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第十三章 高效液相色谱法 ◆学习目的 ◆知识要求 ◆能力要求 掌握高效液相色谱仪的基本结构及仪器的基本操作方法，学会使用高效液相色谱仪对药物进行分离与分析的操作技术。 第一节概 述 第一节 概 述 高效液相色谱法（HPLC）的特点： 以经典液相色谱法为基础 引入气相色谱法的理论和实验技术 高压输送流动相 高效固定相及高灵敏度检测器 现代液相色谱分析方法（具有分离、分析双重作用） 第一节概 述 一、与经典液相色谱法相比 颗粒极细（一般为10?m以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高； 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达10?9g，而荧光检测器最小检测限可达10?12g。 第一节概 述 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 一、主要类型 化学键合相色谱法 离子抑制色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 亲合色谱法 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 二、化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(BPC)。 化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 键合相色谱法的优点： 固定相的均一性和稳定性好，使用过程中不易流失，使用周期长； 柱效高；重现性好； 能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 （一）正相键合相色谱法（固定相极性大于流动相极性） 固定相：极性键合相 如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基键合硅胶。 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调节剂 如烷烃加醇类（正己烷-甲醇）。 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 分离机制： 分配：把有机键合层看作一层液膜，溶质在两相间 溶解。 极性强的组分k大，保留时间（tR）长,后洗脱出柱。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 （二）反相键合相色谱法（固定相极性小于流动相极性） 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS） 辛烷基（C8）键合硅胶。 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂，常用甲醇-水、乙腈-水等。 应用范围：较广泛，适用于非极性至中等极性的组分分离。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 分离机制－保留行为 主要是利用非极性溶质分子或溶质分子中非极性基团与极性溶剂接触时产生排斥力，而从溶剂中被“挤出”，即产生疏溶剂作用，促使溶质分子与键合相表面的非极性的烷基发生疏水缔合，而使溶质分子保留在固定相中。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 保留行为的主要影响因素 溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大；反之亦然。 固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水（洗脱能力弱）为弱溶剂， 醇（洗脱能力强）为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 三、其他高效液相色谱法 （一）离子抑制色谱法（ISC ） 通过调节流动相的pH，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。适用于 3≤pKa≤7的弱酸 7≤pKb≤8的弱碱 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 （二）离子对色谱法（IPC） 把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善分离效果。 该方法适用于分离可离子化或离子型的化合物，如生物碱类、儿茶酚氨类、有机酸类、维生素类、抗生素类药物等。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 分析酸类或带负电荷的物质，一般用季铵盐；如四丁基铵磷酸盐； 分析碱类或带正电荷的物质，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐。 第二节 高效液相色谱法的主要类型及原理 （三）离子色谱法（IC） 离子交换色谱法对许多正、负离子可实现分离。但由于一些常见的无机离子在可见或近紫外区没有吸收，因此难用紫外-可见检测器进行检测。1975年Small提出了将离子交换与电导检测器相结合分析各种离子的方法并称为离子色谱法。 适用于分离阴、阳离子，以及氨基酸、糖类、DNA和DNA水