“从rna提取到荧光定量pcr”解决方案rt-pcr原理简介rt-pcr技术 .ppt

RT引物的选择 模板：总RNA，mRNA，体外转录的RNA 引物：随机引物，Oligo dT，基因特异性引物(GSP) 反转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase 逆转录酶的选择 AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃。 MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最 适37℃或42℃。 Quant Reverse Transcriptase 全新高效逆转录酶，与RNA模板的亲和力强， 对GC含量高的模板通 读效果好，质量稳定，最适37℃。 RNase H的作用 水解RNA-DNA杂合链中的RNA 分离高质量RNA 使用高活性的逆转录酶 提高逆转录酶保温温度 减少基因组DNA污染 * * ―RT系统 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD “从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案 RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南 RT-PCR原理简介 RNA cDNA 目的 片段 PCR RT cDNA第一链合成法示意图（两步法） 一步法实验示意图（同一个反应管中） 适用于mRNA表达量解析 Two Step RT-PCR效率高 使用Random和Oligo-dT 引物可以制备cDNA pool cDNA可长期保存 Two Step RT-PCR cDNA分装 One Step RT-PCR 适用于病毒、病原菌检测 操作简单 污染几率低 RT-PCR两种方法 目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。 目的片段在距Poly(A) Tail 2kbp以内适用。 One Step RT-PCR只能使用Gene specific Primer， 不适用于mRNA表达量分析等复数基因的检出。 Random 6mer 1,500base 目的片段 5’ 3’ R F 5’ 3’ Gene specific Primer 目的片段 R F AAA···A 5’ 3’ 目的片段 R F 2,000base Oligo dT Primer RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南 RT反应体系 RT实验要素－决定反应的特异性及灵敏性 RNA降解或起始量少 RNA提取后含抑制成分 cDNA合成时引物退火 不充分 PCR失败 目的基因在组织中不 表达或表达量低 原因 对 策 分离无污染、高质量的RNA，用0.1－0.5μg乙酰BSA增加RNA的量 用70%乙醇洗涤RNA 确定退火温度适合实验中所用的引物 PCR步骤中cDNA模板不能超过反应体积的1/5 尝试其它组织 问题1：RT-PCR没有产物 问题2：非特异性扩增 RNA中有内源或外源DNA污染 引物和模板非特异性退火 基因特异性引物设计较差 形成引物二聚体 镁离子浓度太高 原因 对 策 用扩增级DNase1处理RNA,使用抗气雾剂的吸头 cDNA合成中使用基因特异性引物，使用递减PCR 遵循用于扩增引物设计的同样原则 设计在3’端没有互补序列的引物 优化镁离子浓度 非特异性扩增 问题3：弥散 cDNA第一链产物的含量过高 DNase降解DNA产生的寡核苷酸的非特异性扩增 PCR反应中引物过多 循环数过多 退火温度过低 原因 对 策 常规PCR步骤中减少模板cDNA的量 提取高质量RNA，防止被DNA污染 减少引物的用量 优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数 提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸 弥 散 RT-PCR原理简介 RT-PCR技术中的关键点 TIANGEN公司RT产品选择指南 400/1380 25/100次 TIANScript cDNA第一链合成试剂盒 KR104 250/850 5000/20000U TIANScript M-MLV ER104-03/04 1400 50次 Quant一步法RT-PCR试剂盒 KR113 1000/3000 25/100次 Quant cDNA第一链合成试剂盒 KR103-03/04 850/1500/2800 25/50/100次 Quant Reverse Transcriptase ER103-02/03/04 价格（元） 包装 产品名称 目录号 TIANGEN公司RT产品系列 谢谢！ 谢谢！ 大家好，我