家畜传染病学实验指导：鸡传染性法氏囊病的诊断.docVIP

实验三十二 鸡传染性法氏囊病的诊断 目 的 熟悉和掌握鸡传染性法氏囊病的诊断方法。 内容及方法 临诊诊断的要点 鸡传染性法氏囊病(1BD)是由一种双股RNA病毒种法氏囊病病毒引起鸡的一种急性 接触性传染病。根据本病的流行特点、临床症状和剖检变化可作出诊断，其诊断要点如下。 1．流行特点 IBD仅发生于鸡，多见于雏鸡和幼龄鸡，以3—6周龄鸡最易感。成年鸡 感染后一般呈隐性经过。在易感鸡群中，往往是突然发病，头2天死亡不多，第3～5天死 亡达到高峰，第7天后死亡减少或停止死亡。 2．临床症状 本病在初发生的鸡群多呈急性经过，早期症状表现为有的鸡啄肛门和羽 毛现象，随着病鸡出现下痢、食欲减退、精神萎顿、畏寒、消瘦、羽毛无光泽，病鸡脱水虚弱而死亡。死亡率一般在5％～25％，如毒力强的毒抹侵害，其死亡率可达60％以上。 3．病变 剖检时特征性病变，见胸肌、腿肌肌肉出血，腺胃和肌胃交界处有带状出血。 法氏囊水肿比正常大2～3倍。法氏囊明显出血，粘膜皱褶上有出血点，里面粘液较多，如出血严重者法氏囊象红色李毒。病理长的法氏囊内有干酷样物质，整个囊变硬。有淤病例法氏囊萎缩。肾肿大并有尿酸盐沉积，盲肠扁桃体肿大、出血。 二、实验室的诊断 IBD的实验室诊断，取决于病毒的特异性抗体的检测，或组织中病毒的血清学检查，通 常不把病原分离和鉴定作为常规诊断的目的。 1．琼脂凝胶沉淀试验 本法是检测血清中特异性抗体或法氏囊组织中病毒抗原的最 常用诊断方法。 (1)病料采集 采集发病早期的血液样品，3周后再采血样，并分离血清。为了检出法氏囊中的抗原，无菌采取10只鸡左右的法氏囊，用组织搅拌器制成匀浆，以3 000r／min离 心10min，取上清液备用。 (2)IBD的标准阳性血清和阴性血清。 (3)琼脂板制备 取1g优质琼脂溶化于含有0.1％石碳酸的8％氯化钠溶液100ml，经 多层纱布脱脂棉过滤，置冰箱备用。有时放在水溶液化并趁热浇在玻片上，每片4mi，厚约 2．5～3mm。也可以吸15ml倒人90mm平皿内。 (4)打孔和加样 事先制好打孔的图案(中央1个孔和外周6个孔)，放在琼脂板下面，用批孔器打孔，并剔去孔内琼脂。孔径为6mm，孔距为3mm。检测IBDV的抗体时，中央孔和已知的IBDV的抗原，若测法氏囊中的病毒抗原，中央孔加已知标准阳性血清。现以检 测抗原为例进行加样。中央孔加IBD的阳性血清，1、4孔加入已知抗原，2、3、5、6孔加 入被检抗原，添加孔满为止，将平皿倒置放在湿盒内，置37℃温箱内经24～48h观察结果。 (5)结果判定 在标准阳性血清与被检的抗原孔之间，有明显沉淀线者判为阳性，相 反，如果不出现沉淀线者判为阴性。标准阳性血清和已知抗原孔之间一定要出现明显沉淀 线者，本试验方可确认。 2．免疫荧光抗体检查 (1)荧光抗体 成都兽医生物药品厂生产 (2)被检材料 采取病死鸡的法氏囊、盲肠扁桃体、肾和脾，用冰冻切片制片后，用丙酮固定10min。 (3)染色方法 在切片上滴加IBD的荧光抗体，置湿盒内在37℃感作30min后取出，先 用pH7.2PBS液冲洗，继而用蒸馏水冲洗，自然干燥后滴加甘油缓冲液封片(甘油9份， pH7.2PBSl份)镜检。 (4)结果判定 镜检时见片上有特异性的荧光细胞时判为阳性，不出现荧光或出现非 特异性荧光则判为阴性。 (5)注意事项 滴加标记荧光抗体于已知阳性标本上，应呈现明显的特异荧光。滴加 标记荧光抗体于已知阴性标本片上，应不出现特异荧光。本法在感染12h就可在法氏囊和盲肠扁桃体检出。 3. 病毒中和试验 可用细胞培养或幼龄鸡进行，他比琼脂凝胶沉淀试验检测抗体更敏 感，对估价疫苗的免疫应答是有用的。 (1)细胞培养中和试验 在微量滴定板的每孔中，加入0.5ml含100TCID50的病毒稀释液。被检血清经56℃灭能30min，然后以滴定板上的病毒稀释液将被检血清作连续倍比稀释。滴定板在室温放30min后，每孔加入0.2ml制备好的鸡胚细胞悬液，置37℃培养4～5天，每天在倒置显微镜观察细胞病变产生的情况，并以不出现细胞病变的最终稀释度的倒数(log2)判定终点。 (2)用鸡用中和试验 将被检血清在56℃灭能30min。取lml被检血清与lml已知阳 性IBD抗原(可用细胞培养毒，lml含200TCID50／0.05ml，或用清亮的10％法氏囊匀浆) 合，置37℃孵良30～60min。将上述混合物滴入7只易