重组dna药物（药学专业）.ppt

重组DNA药物Recombinant DNA Drugs 三峡大学医学院 盛 德 乔 shengdq@ctgu.edu.cn QQ:834309103 重组DNA药物：应用重组DNA技术（包括基因工程技术和蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。 重组基因的表达？ 克隆基因的表达 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 表达体系包括： 表达载体 原核表达载体 真核表达载体 宿主细胞 大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌（原核） 酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞（真核） 1. 原核表达体系 (E.coli 表达体系) 标准： 选择标志 多接头克隆位点 强启动子 翻译调控序列 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。 大肠杆菌表达载体的结构 除了含有与克隆载体相同的元件之外，还必须含有表达载体所需要的其它元件: 启动子 是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的序列 大肠杆菌表达系统常用的启动子有：lacZ启动子 强启动子 核糖体结合位点 SD序列（Shine-Dalgarno sequence）--mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。 SD序列与AUG之间的距离也会影响翻译效率，一般以5～13个碱基为宜 表达载体都含有相应的SD序列及适当长度的SD-ATG间隔距离 终止子 基因或操纵子3′的一段核苷酸序列 在表达载体中多放在多克隆位点的下游 常用的大肠杆菌表达载体 非融合蛋白表达载体 表达的蛋白与天然状态下存在的蛋白在结构、功能、免疫原性方面基本一致。 融合蛋白表达载体 融合蛋白（fusion protein）－表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末端由克隆的真核DNA编码。 这类载体SD-ATG间隔已固定，翻译起始信号组织合理，其表达的蛋白在其N-端或C-端常融合有一段细菌的多肽或蛋白质。 pGEX序列载体 （Pharmacia公司） GST系统 b-半乳糖苷酶系统 麦芽糖结合蛋白系统 蛋白A系统 IgG-Sepharose 表达标签 tag 常用的标签有： GST-谷光甘肽-S-转移酶，glutathione-S-transferase）多肽 ，凝血酶（Thrombin）水解蛋白去掉GST标签 FLAG-DYKDDDDK，专门设计用于融合蛋白质的免疫吸附纯化 HA (influenza hemagglutinin epitope-YPYDVPDYA)流感血凝素抗原决定簇 His-C末端、N末端、或内部带有6×His标签(His-tagged)的融合蛋白 c-myc (EQKLISEEDL) 方便蛋白的鉴定和纯化！ 大肠杆菌表达系统 优点： 遗传背景清楚 用大肠杆菌进行遗传操作的方法非常完善 生长繁殖周期短 表达中的问题 缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA; 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化; 融合蛋白形成包涵体（inclusion body），复性后才有活性; 很难表达大量的可溶性蛋白。 为什么建立真核表达系统？ 原核表达系统的缺陷：不能对表达的真核蛋白进行正确的折叠和翻译后加工!!! 哺乳动物细胞表达系统 2. 真核表达体系 真核细胞：酵母、昆虫、哺乳类动物细胞 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时 真核表达载体 真核表达载体的功能元件 原核DNA序列 启动子 增强子 剪接信号 终止信号和加poly(A）信号 筛选标记 新霉素抗性基因 neor 胸苷激酶基因tk 真核表达载体的种类 质粒型载体 pcDNA系列 Invitrogen公司产品 pCMV-HA Clontech公司产品 病毒型载体 逆转录病毒载体 腺病毒载体 昆虫杆装病毒载体 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法： 磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 （Lipofectamine invitrogen 公司产品,实验室常用） 显微注射 转染（病毒载体） 外源基因在真核细胞中的表达方式 依表达时间长短 瞬时表达（一过性表达） 不整合 稳定表达 筛选 表达方式 分泌表达，非分泌表达 融合表达，非融合表达 瞬间表达Transient expression :外源基因不整合到宿主染色体中，不能复制，在细胞中的表达时间较短(2-3天)，转染的方法相对简单，耗时较少，适用快速分析. 稳定表达Stable e