活细胞内以光漂白荧光损失(flip)技术分析hur - 中国细胞生物学学报.pdf

网络出版时间：2014-08-28 10:14 网络出版地址：/kcms/doi/10.11844/cjcb.2014.09.0134.html 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2014, 36(9): DOI: 10.11844/cj cb.2014.09.0134 活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR 蛋白的应激动力学行为 1# 2# 3 1 3 3 1 高星杰 张 毅 付 雪 苏 超 张春燕 张桂敏 尹 洁 3 3 1,3* 王鑫廷 姚 智 杨 洁 1 2 ( 天津医科大学基础医学研究中心, 天津300070; 天津医科大学药学院, 天津300070; 3天津医科大学基础医学院, 天津300070) 摘要 人类抗原R(human antigen R, HuR)是一种多功能RNA结合蛋白, 参与细胞应激颗粒 (stress granules, SGs)的构成。SGs是细胞在受到外界环境刺激时在胞浆中形成的颗粒状结构。该 研究是利用光漂白荧光损失(fluorescence loss in photobleaching, FLIP)技术对活细胞内的HuR蛋 白颗粒进行应激动力学分析。首先, 利用脂质体将RFP-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞, 以 Western blot和细胞免疫荧光实验确定是否实现对于HuR蛋白的红色荧光蛋白(red fluorecent protein, RFP)标记; 然后以405 nm激光束脉冲式重复光漂白HuR应激颗粒, 分别监测同一漂白细胞内的其他 HuR颗粒以及核内荧光信号, 并以邻近的未漂白细胞为对照组。实验结果表明, 转染重组质粒后可 有效表达RFP-HuR融合蛋白, 且与SGs标记蛋白G3BP蛋白存在共定位关系。在第一个光漂白循环, 漂白区荧光密度便从2 500 a.u.降低至0 a.u.; 而经过约12个漂白循环(240 s)后, 邻近HuR颗粒的荧光 密度从漂白前的1 800 a.u.左右降低并维持在200 a.u.左右, 表明活细胞内的HuR颗粒呈现高度的动 态性; 而胞核区荧光密度亦从4 400 a.u.降低至2 000 a.u.左右, 表明HuR蛋白是一种核浆穿梭蛋白, 在SGs、胞浆及胞核之间存在一定的动态平衡。利用FLIP技术可以分析并比较SGs不同成分的应 激动力学属性, 有助于进行SGs相关临床疾病的分子机制探讨。 关键词 HuR蛋白; 光漂白荧光损失; 应激颗粒; 活细胞; 荧光标记 The Analysis on the Dynamic Properties of HuR Granules in