基于鞭毛蛋白基因的坚强芽孢杆菌特异性套式pcr 和 - 渔业科学进展.pdf

第36 卷 第3 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.36, No.3 2 0 1 5 年 6 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Jun., 2015 DOI: 10.11758/yykxjz / 基于鞭毛蛋白基因的坚强芽孢杆菌特异性套式 PCR 和荧光定量PCR 方法的建立* 1,2 1 1,2 1,3 1,2,3① 许彦芬 王海亮 陈大菾 宋晓玲 黄 倢 (1. 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071 ； 2. 上海海洋大学 上海 201306 ；3. 青岛海洋科学与技术国家重点实验室 青岛 266071) 摘要 细菌鞭毛蛋白编码基因hag 具两端的保守序列及中间可变区域，在细菌的分类和鉴定中可 作为分子标记。本研究克隆了坚强芽孢杆菌鞭毛蛋白编码基因hag 部分序列，根据所得核酸序列设 计套式引物Bfho 和Bfhi ，进行菌株的套式PCR 特异性检测。此外，采用内引物Bfhi 建立坚强芽 孢杆菌荧光定量PCR 特异性检测方法并确定该方法的检测限，对15 个模拟样品进行检测并对阳性 组中坚强芽孢杆菌的含量进行定量分析。结果显示，克隆得到的坚强芽孢杆菌hag 基因长为1213 bp， 经比对，与枯草芽孢杆菌 hag 基因相似性为 13%−15%。荧光定量PCR 方法对坚强芽孢杆菌菌株 3 3 PC004 和PC024 的检测限分别为17.3×10 和19.7×10 CFU/ml 。模拟样品检测结果显示，15 个样品 中检测出7 个阳性，并同时定量各样品中坚强芽孢杆菌的含量。本研究建立的坚强芽孢杆菌检测方 法特异性强、操作时间短、灵敏度高，可为该菌的实际检测提供技术支持。 关键词 坚强芽孢杆菌; 鞭毛蛋白; hag 基因; 套式PCR; 荧光定量PCR 中图分类号 S917 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2015)03-0068-06 益生菌(Probiotics)在水产养殖中的应用倍受重 现了许多益生菌相关产品，快速特异的益生菌检测技 视，不仅可以改善水体、促进水生动物生长，还能够 术是评估实际使用效果、监测益生菌动态以及鉴定相 通过非特异性免疫增强其免疫力和抗病性，具有十分 关产品质量等的必要手段。但专门针对有益菌的快速 显著的效果( 王艳池等, 2011; Dalmin et al, 2001; 特异性的检测方法很少报道，多数是基于非特异的简 Wang et al, 2005; Sakata, 1990)。芽孢杆菌(Bacillus) 单平板计数法，研究中也有采用 16S rDNA 测序或 作为有益菌中的主要种类，现已受到广大研究者的青 16S−23S rDNA 测序分析方法。16S rDNA 序列分析 睐，其中坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)在增强免疫 已广泛用于细菌的属、种和科的鉴定(Amann et al, 力、抵抗白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, 1995; Woese, 1987)，而16S−23S rDNA 分析方法可有 WSSV)侵染方面有显著作用(刘君等, 2012; 孙艳等, 效区分形态、分类地位相近的细菌，成为细菌种和亚 2012) 。中国水产科学研究院黄海水产研究所养殖生物 种水平分类鉴定的有利工具(Jensen et al, 1993)。本实 疾病控制与分子病理学研究室已分离得到两株坚强芽孢 验室先前的研究表明，坚强芽孢杆菌 16