线粒体转录复合物相关蛋白原核表达与纯化 - 中国医学科学院学报编辑部.pdf

中 国 医 学 科 学 院 学 报 ＡＣＴＡＡＣＡＤＥＭＩＡＥＭＥＤＩＣＩＮＡＥＳＩＮＩＣＡＥ ·论　著 · 线粒体转录复合物相关蛋白原核表达与纯化 刘　光，杨瑞锋，石秉炀，刘德培 中国医学科学院　北京协和医学院　基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 １００００５ 通信作者：刘德培　电话：０１０传真：０１０电子邮件：ｌｉｕｄｐ＠ｐｕｍｃｅｄｕｃｎ 　　摘要：目的　获取人线粒体转录因子Ａ（ＴＦＡＭ）、线粒体转录因子Ｂ１（ＴＦＢ１Ｍ）、线粒体转录因子Ｂ２（ＴＦＢ２Ｍ） 基因片段，高效表达和纯化带有谷胱甘肽转移酶 （ＧＳＴ）标签的ＧＳＴＴＦＡＭ、ＧＳＴＴＦＢ１Ｍ、ＧＳＴＴＦＢ２Ｍ融合蛋白。方法 　设计引物扩增得到ＴＦＡＭ、ＴＦＢ１Ｍ、ＴＦＢ２Ｍ的ｃＤＮＡ片段，通过引入的酶切位点克隆至表达载体ｐＥＴ４２ａ，构建重组表 达载体，并导入ＥｃｏｌｉＢＬ２１宿主菌中，异丙基硫代半乳糖苷 （ＩＰＴＧ）诱导表达重组的ＧＳＴ融合蛋白，谷胱甘肽琼脂糖 珠纯化表达产物，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ＳＤＳＰＡＧＥ）进行分析鉴定。结果　获得 ｐＥＴ４２ａＴＦＡＭ、 ｐＥＴ４２ａＴＦＢ１Ｍ、ｐＥＴ４２ａＴＦＢ２Ｍ表达质粒，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ的基因序列一致。ＳＤＳＰＡＧＥ分析结果显示，重组ＧＳＴ ＴＦＡＭ、ＧＳＴＴＦＢ１Ｍ、ＧＳＴＴＦＢ２Ｍ融合蛋白分别在相对分子质量５６０００、６７０００、６９０００处出现特异性蛋白条带，经ＧＳＴ 亲和层析纯化后，得到高纯度的融合蛋白。结论　成功构建了基因重组体 ｐＥＴ４２ａＴＦＡＭ、ｐＥＴ４２ａＴＦＢ１Ｍ、ｐＥＴ４２ａ ＴＦＢ２Ｍ，制备了ＧＳＴＴＦＡＭ、ＧＳＴＴＦＢ１Ｍ、ＧＳＴＴＦＢ２Ｍ融合蛋白。 关键词：线粒体转录因子Ａ；线粒体转录因子Ｂ１；线粒体转录因子Ｂ２；融合蛋白；纯化 中图分类号：Ｑ７８２　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１０００５０３Ｘ（２０１１）０６０６３８０６ ＤＯＩ：１０３８８１／ｊｉｓｓｎ１０００５０３Ｘ２０１１０６０１１ ＰｒｏｋａｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＣｏｍｐｌｅｘＰｒｏｔｅｉｎｓ ＬＩＵＧｕａｎｇ，ＹＡＮＧＲｕｉｆｅｎｇ，ＳＨＩＢｉｎｇｙａｎｇ，ＬＩＵＤｅｐｅｉ ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ， ＣＡＭＳａｎｄＰＵＭＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００００５，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＩＵＤｅｐｅｉ　Ｔｅｌ：０１０Ｆａｘ：０１０Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｄｐ＠ｐｕｍｃｅｄｕｃｎ ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｏｂｔａｉｎｈｕｍａｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＡ（ＴＦＡＭ），ｍｉｔｏｃｈｏｎ ｄｒｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＢ１（ＴＦＢ１Ｍ），ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＢ２（ＴＦＢ２Ｍ）ｔｈａｔｗｅｒｅｅｘ ｐｒｅｓｓｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙｉｎＥｃｏｌｉＢＥ２１ａｎｄｔｏｐｕｒｉｆｙｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｓＭｅｔｈｏｄｓ　ＴＦＡＭ，ＴＦＢ１Ｍ，ａｎｄ ＴＦＢ２Ｍｓｅｇｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄ