elisa检测中存在的问题及对策.ppt

ELISA试剂的选用和质检 上海心语生物科技有限公司 影响试剂盒质量的因素 试剂盒的选用 试剂盒的质检方法 目前试剂盒存在的问题 影响试剂盒质量的因素 1．原材料 (1)固相材料 商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其对ELISA试剂盒的影响在于孔间的显色差异。 (2)抗原 --自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。 纯 度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。 立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的抗HCV和抗HIV抗体的检测有可能导致结合上述决定簇的抗体漏检。 影响试剂盒质量的因素 (3)抗体 多克隆抗体(多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定簇，但抗体的亲和力和特异性相对要低于单抗，且每次制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。 单克隆抗体(单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心ELISA测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使用一步法时“钩状”效应(Hookeffect)的出现。因此，在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时，包被和指示抗体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗，包被抗体可为混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全地结合待测物中的特异抗原。 影响试剂盒质量的因素 (4)酶结合物 ELISA试剂盒的核心部分，通常ELISA试剂盒的有效使用期限即是根据酶结合物的稳定性而定的。 辣根过氧化物酶(HRP)：易于提取，价格相对低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。 碱性磷酸酶(ALP)：碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用 F半乳糖甘酶 影响试剂盒质量的因素 (5)色原底物：HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB) 。 邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。 四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的A、B两种液态试剂，即一定浓度双氧水溶液和TMB。它们在溶液中相对不稳定，因此在使用ELISA试剂盒时，如底物A·或／和B出现颜色，或各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。 · 影响试剂盒质量的因素 2．试剂盒的方法学设计 双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp) 影响试剂盒质量的因素 间接法测抗体（抗HCV、Tp) 影响试剂盒质量的因素 双抗体夹心法测抗原-两步法 影响试剂盒质量的因素 双抗体夹心法测抗原-一步法 影响试剂盒质量的因素 3．试剂盒的运输和贮存 ELISA试剂盒的效期一般为6个月，这是指在贮存温度为2～8oC的情况下，但一个试剂盒从出厂至用户手中，均要经历运输(如送检、检定、发货等)及运输中的贮存，某一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。 试剂盒的选用 1．根据可能影响试剂盒质量的因素，从以下几个方面来判断该试剂盒是否符合我们的要求 效期 固相材料的来源 包被抗体或抗原的性质(单抗、多抗或合成多肽或重组多肽) 显色底物(是TMB还是OPD) 测定模式(一步法或二步法) 试剂盒的选用 2．同行对有关试剂盒的使用效果 个别的使用效果 在实际工作中，其它实验室对某种试剂盒的实际使用效果，往往具有很强的说服力。 综合的使用评价 对一种试剂盒的综合使用评价，是指多个实验室对这种试盒实际应用效果的综合分析。 ELISA试剂盒的质检 1.包装、储存状态 内外包装、效期、试剂瓶是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全等等 2.采用血清盘(panel)质检 血清盘由一定数量的阴、阳性样本组成，可用来判断试剂盒的灵敏度、特异性和符合率，如HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盘。 ELISA试剂盒的质检 ELISA试剂盒的质检-HBsAg ELISA试剂盒的质检-抗HCV ELISA试剂盒的质检-TP ELISA试剂盒的质检 3.采用弱阳性定值质控血清进行质检 对不同厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同一弱阳性定值质控血清检测，可比较出不同厂家或不同批号试剂盒的检测灵敏度(测定下限)的差异，对判断试剂盒的质量及其稳定性具有重要的参考价值。 检验结果的正确与否，是试剂盒质量、人员素质、仪器设备状态和室内质控措施等的综合反应，任何一个环节出现问题，都会导致检测的失败。 目前试剂盒存在的问题--抗HCV 目前试剂