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应用说明 QuantStudio 3D数字PCR系统 QuantStudio 3D数字PCR系统在 H7型禽流感病毒载量的应用 本应用说明介绍了采用QuantStudio™ 3D数字PCR 系统进行H7型禽流感病毒定量的 工作流程。利用该工作流程可以在QuantStudio 3D数字PCR系统上获得稳定的定量 数据，让RNA病毒载量的测定更加准确、简单。 介绍 测定样品中致病性病毒的载量是实时荧光定量PCR (qPCR)的一个常见应用。但qPCR 实验相对繁琐，因为qPCR的定量依赖于PCR效率和由已知浓度的参照标准品而绘 制的标准曲线。数字PCR是一种全新的核酸检测和定量方法。数字PCR技术与传统 的实时荧光定量PCR方法不尽相同。数字PCR是将一份样品分配到数万个反应单元 中，而这些反应单元中只有部分含有目标分子。在经过PCR扩增和信号分析后，采用 Poisson模型来计算样品中目标分子数，无需标准品即可完成绝对浓度的定量(图1)。 制备样品 划分样品 扩增DNA 计算结果 gDNA/cDNA 样品分成多个反应 阳性反应孔 拷贝数/µl 阴性反应孔 图1. 数字PCR。数字PCR的实验流程也非常简单，如图2所示，将稀释的样本与QuantiStudio 3D 数字PCR预混液及引物和探针混合，再上样至QuantiStudio 3D数字PCR芯片，组装密封芯片，置 于PCR仪上扩增，最后在QuantiStudio 3D数字PCR仪上读取结果。还可以利用QuantiStudio 3D AnalysisSuite Cloud软件查看数据，做进一步分析。 封闭体系，防止污染 体系配制 芯片上样 PCR扩增 芯片读取 图2. 数字PCR实验。 QuantStudio 3D数字PCR实验流程 探针引物设计 PCR扩增 QuantStudio 3D数字PCR系统使用的探针引物无特别之处。 封装好的芯片置于PCR仪上按照表2的条件进行扩增。 国家标准和行业标准中针对qPCR技术推荐的各种检测探针 温度 时间 阶段 引物也同样适用于数字PCR。本实验的H7探针引物即来源 96℃ 10 min hold 于WHO ，国家CDC推荐。 96℃ 30 s H7探针引物序列 50℃ 1 min 40 cycles 正向引物 AGAAATGAAATGGCTCCTGTCAA 72℃ 1 min 反向引物 GGTTTTTTCTTGTATTTTTATATGACTTAG 72℃ 2 min hold 探针 FAM-AGATAATGCTGCATTCCCGCAGATG-BHQ1 10℃ ∞ hold 表2: 芯片扩增条件。 样品制备 数据读取和分析 使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (11754-050)将 扩增完毕的芯片即可在QuantStudio 3D数字 PCR仪上进行 H7型禽流感病毒RNA反转录合成cDNA ，并进