重组玉米f型和m型硫氧还蛋白的功能确定及其靶向蛋白的捕获.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（５）：６３６８ ? 重组玉米ｆ型和ｍ型硫氧还蛋白的功能确定 及其靶向蛋白的捕获 冯爱花　张国明　亓振国　范　军 （安徽省作物生物学重点实验室 安徽农业大学生命科学学院　合肥　２３００３６） 摘要　ＲＴＰＣＲ从玉米幼叶总ＲＮＡ中克隆ｆ型和ｍ型硫氧还蛋白（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，Ｔｒｘ）的编码基因， 分别将两种类型Ｔｒｘ活性中心的第二个保守Ｃｙｓ残基定点突变成Ｓｅｒ残基和Ａｌａ残基。在大肠杆 菌分别重组表达和纯化了含组氨酸标签的Ｔｒｘ及其突变体蛋白，ＳＤＳＰＡＧＥ显示纯化的蛋白显示 一条主带，蛋白分子量分别估计为ｆ型Ｔｒｘ为１８ｋＤａ，ｍ型Ｔｒｘ为１４ｋＤａ；纯化的含有ＳＵＭＯ标签融 合Ｔｒｘ，用ＳＵＭＯ专一性ＳＵＭＯ水解酶Ｕｌｐ除去ＳＵＭＯ，等点聚焦电泳显示ｍ型和ｆ型Ｔｒｘ的等电 点分别为４．６和５．９。ｍ型Ｔｒｘ比ｆ型Ｔｒｘ有更强的还原胰岛素能力，而突变体蛋白几乎没有还原 能力。用Ｃｙｓ残基专一性标记化合物ＡＭＳ标记Ｔｒｘ，显示野生型Ｔｒｘ有氧化还原态，而突变体蛋 白仅有还原态。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳显示固定化的ｆ型Ｔｒｘ突变体比ｍ型Ｔｒｘ突变体捕获的玉米幼叶 靶蛋白更具有多样性。 关键词　ｆ型和ｍ型硫氧还蛋白　玉米　定点突变　功能分析　靶蛋白捕获 中图分类号　Ｓ１８８ ［６］ 　　硫氧还蛋白（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，Ｔｒｘ）是一类小分子量蛋 不同 。此外，还发明了其它方法，但需要纯化的Ｔｒｘ 白，具有二硫键异构酶活性，它们作为生物氧化还原信 ［７］ 或者突变体蛋白 。 ［１］ 号的主要传递者，在蛋白翻译后修饰起重要作用 。 　　目前，禾本科Ｔｒｘ的性质研究较少。水稻Ｔｒｘ家族 高等植物Ｔｒｘ的种类最为丰富，分布在细胞质、线粒体 候选蛋白编码基因的表达谱分析显示与光周期和激素 ［８］ 和叶绿体中，其中，叶绿体的Ｔｒｘ种类最多，主要为ｆ型 水平有关 。抑制水稻一种 ｍ型Ｔｒｘ表达，植株性状 和ｍ型，它们的活性中心都含有保守的ＷＣＧＰＣ模块， 发生明显变化，主要是受 Ｔｒｘ调节的靶蛋白活性下 两个Ｃｙｓ残基通过还原态巯基和氧化态二硫键的相互 ［９］ 降 。玉米是Ｃ４作物，叶绿体Ｔｒｘ的活性及结合的靶 转化，催化靶蛋白的巯基和二硫键之间的相互转化，引 蛋白尚没有报道。根据玉米自交系Ｂ７３的幼叶ｃＤＮＡ ［２］ ［１０］ 起靶蛋白构象改变，导致活性变化 。 序列 ，克隆玉米编码一种ｆ型和ｍ型Ｔｒｘ成熟蛋白 　　植物叶绿体Ｔｒｘ的研究首先源于菠菜，研究了ｆ型 的基因，研究了野生型和突变体Ｔｒｘ的功能。 Ｔｒｘ（Ｔｒｘｆ）和ｍ型Ｔｒｘ（Ｔｒｘｍ）的功能，拟南芥叶绿体ｆ １　材料与方法 ［３］ 型和ｍ型Ｔｒｘ含有多个亚型，其活性存在差异 。已 阐明豌豆两种类型Ｔｒｘ在根和花的质体分布以及新的 １．１　材　料 ［４］ １．１．１　菌株、质粒和自交系　大肠杆菌ＤＨ５ 和ＢＬ２１ 功能 。对菠菜两种类型的Ｔｒｘ第二个 Ｃｙｓ残基的定