条浒苔rubisco酶大亚基基因编码序列rbcl全长cdna克隆 - 水产学报.doc

缘管浒苔rbcL全长cDNA克隆与序列分析 应成琦1 2，尹顺吉1，林森杰3，沈轶1，何培民1 （1.上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室，上海 201306； 2.中国水产科学研究院东海水产研究所 中国水产科学研究院盐碱地渔业工程技术中心，上海200090； 3. Department of Marine Sciences, University of Connecticut, Groton, CT 06340, USA） 摘要：首次对大型海藻——缘管浒苔光合作用第一关键酶Rubisco大亚基基因(rbcL)全长cDNA序列进行了克隆分离。首先应用RT-PCR方法获得了rbcL大片段cDNA序列，序列长度为1101bp ，并进行了测序分析。然后分别应用5’RACE方法和3’RACE方法获得2个克隆序列，其序列长度分别为371bp 和579bp,并进行了测序分析。在此基础上，将3个片段序列进行拼接，获得了Rubisco大亚基全长cDNA序列(1472bp)，其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列（NCBI登录号：DQ813496），并推断出蛋白质序列（474个氨基酸）。对序列进行了相关生物信息分析和同源性比对，结果显示与已克隆出全长rbcL基因的7种绿藻比较具有较高同源性，核苷酸序列和蛋白质序列同源性分别达到了82.07% ～ 85.78%和88.00%～- 94.11%，其中与Chlorella pyrenoidosa蛋白质序列同源性最高，为 94.11%。在此基础上，使用生物信息学软件对缘管浒苔rbcL氨基酸序列与其它植物或藻类进行了多序列比对，并且进一步应用在线软件程序进行了蛋白质的二级结构分析和三级结构预测。 关键词：核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因（rbcL基因）； 缘管浒苔； 前导序列；； 中图分类号：S917 文献标识码：A 收稿日期：2009-12-28 修回日期：2010- 第一作者：应成琦 (1983- )，男，上海人，硕士研究生，主要从事研究。E-mail： 通讯作者：何培民，Tel：，E-mail：pmhe@ 基金资助：国家海洋局绿潮灾害专项课题、国家自然科学基金项目、教育部博士点基金项目、上海市科委优秀学科带头人计划项目（08XD14037）、上海市水生生物学重点学科资助项目(S30701) 核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase, E.C.9,简称Rubisco)是光合作用还原和光合氧化二个连锁循环的交叉点，为调节光合作用和光呼吸、决定净光合速率的第一关键酶[1-2]。在高等植物和绿藻中，Rubisco由8个大亚基及8个小亚基组成，大亚基由叶绿体基因组编码（简称为rbcL 基因）,小亚基由核基因组编码（简称为rbcS 基因）[3]。 真核藻类Rubisco全酶的底物活化中心和催化中心都位于大亚基上，因此研究Rubisco大亚基编码序列rbcL及其大亚基氨基酸序列对于深入研究其蛋白特殊的功能结构域和酶作用机理具有尤为重要的意义[2，4]。此外，rbcL基因序列已成为分子系统学研究中使用最为广泛的分子指标之一，用于探测植物间的系统关系和分子进化[4]。因此，近年来，rbcL基因编码区序列资料迅速增长，自1980 年首次测定了玉米rbcL 基因的序列以来,迄今已有1500余种植物的rbcL基因序列得以测定，而且新的数据还在日益增多，但完整rbcL基因序列仍然很有限[4-5]。迄今为止，在Genbank中，已有许多关于绿藻的叶绿体rbcL基因序列的报道，但绝大多数是使用通用引物，得到的只是rbcL的一个大片段；少数获得了rbcL基因全序列，但全部为微型绿藻，且通常只有一个ORF，缺少关于3’和5’非翻译区的信息；未见到关于大型海藻rbcL cDNA完整序列的报道。 缘管浒苔Ulva linza)隶属绿藻门（Chlorophycophyta）,绿藻纲（Chlorophyceae），石莼目（Ulvales），石莼科(Ulvaceae)。作为一种大型经济海藻，其产品清香独特，具有抗癌及抗溃疡等药用价值[6]，在日本及韩国已大规模栽培生产，我国南方也已开始栽培生产。浒苔藻体生长很快，其日相对生长率可高达50% [7]，具有快速吸收氮磷改善水质等生态修复功能 [8]。但近年来由于海洋富营养化现象越来越严重，大型绿藻形成的“绿潮”发生的频率不断增加，这既是大自然对人类活动的一种警示，也是一种自我修复作用现象 [8]。为了揭开浒苔快速生长机制，我们特选取缘管浒苔为材料，首次克隆了其光合作用关键酶Rubisco大亚基基因的