牙鲆(paralichthys olivaceus) cd59 基因的原核表达与 - 渔业科学进展.pdf

第38 卷 第3 期 渔 业 科 学 进 展 Vol.38, No.3 2 0 1 7 年 6 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Jun., 2017 DOI: 10.11758/yykxjz.20160411001 / 牙鲆(Paralichthys olivaceus) CD59 基因 的原核表达与功能探究* 周纳宇 曹丹丹 王志刚 张全启 齐 洁 王旭波 于海洋① ( 中国海洋大学海洋生命学院 海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室 青岛 266003) 摘要 本研究分析了CD59 基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)感染鳗弧菌(Vibrio anguillarum)前 后的表达模式。结果显示，感染前，CD59 基因在检测的4 种免疫器官中均不表达；感染后，该基 因均有不同程度的表达，其中，肾脏的表达量最高。对牙鲆CD59 基因进行原核表达，构建原核表 达载体pET-32a-CD59 ，并将其转化入大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 ，使用异丙基-β-D-硫代半乳 糖苷(IPTG)诱导，获得约为 29 kDa 的重组蛋白 pET-32a-CD59 。该蛋白以包涵体形式存在，通过 His 亲和层析柱纯化和超滤管浓缩目的蛋白后，经SDS检测得到单一条带，纯化效果较好。 Western blotting 分析结果显示，重组蛋白pET-32a-CD59 可以与抗His 单克隆抗体发生特异性反应， 说明牙鲆CD59 基因在大肠杆菌系统中成功表达。对重组蛋白进行透析复性，复性结束后，蛋白无 析出或絮状沉淀，初步表明复性成功。选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 、鳗弧菌、金黄色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌4 种致病指示菌，测定复性重组蛋白pET-32a-CD59 的 抑菌活性。研究表明，重组蛋白pET-32a-CD59 对嗜水气单胞菌具有一定的抑菌活性。本研究旨在 探究牙鲆免疫调节机制，并为提高牙鲆养殖效率提供一定的分子理论基础。 关键词 牙鲆；CD59 ；原核表达；抑菌活性 中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 2095-9869(2017)03-0070-08 牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水 链球菌(Streptococcus)等(周丽等, 1997) 。其中，由鳗 养殖鱼类，主要分布于日本，韩国和中国的沿海地区 弧菌引起的鳗弧菌病是一种危害性较大的细菌性疾 (Seikai, 2002) ，其肉质细嫩、营养丰富，深受广大消 病，致死率较高，且在世界范围内流行(Egidius, 1987; 费者的喜爱。在我国牙鲆养殖业蓬勃发展的同时，由 杨少丽等, 2005) 。 于牙鲆人工养殖特别是高密度集约化养殖条件与天 由于牙鲆细菌性病害死亡率高，对养殖业存在严 然环境差别很大，导致各种疾病时有发生。牙鲆养殖 重危害，研制稳定、可靠的商品疫苗预防细菌性疾病 病害日趋严重，已成为制约其养殖发展的重大障碍。 的暴发，培育具有抗细菌性疾病的优良品种是牙鲆病 牙鲆病害主要有病毒性和细菌性疾病，在我国细 害防治的主要途径。无论采用哪种途径，首先必须深 菌性疾病危害最为严重。牙鲆的病原细菌有许多种， 入了解鲆鲽类受细菌感染的影响，研究牙鲆免疫相关 主要包括鳗弧菌( Vibrio anguillarum) 、迟缓爱德华氏 分子机理。在脊椎动物中，免疫系统通常被分为两个 菌(Edwardsiella tarda) 、溶藻弧菌( Vibrio alginolyticus) 、 相互独立又相互关联的亚系统，即先天性免疫和获得 * 国家自然科学基金项目(