抗虫转基因水稻pcr方法.doc

GB 中华人民共和国国家标准 农业部953号公告－6－2007 转基因植物及其产品成分检测 抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法 Detection of genetically modified plants and their derived products —Qualitative PCR methods for Bt rice to control insect pests 2007-12-18发布 2008-03-01实施 中华人民共和国农业部 发 布 前 言 本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准附录A、附录B为规范性附录。 本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院生物技术所、上海交通大学、中国农业科学院植物保护研究所、中国农业大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：金芜军、刘信、杨立桃、张永军、黄昆仑、宋贵文、李宁、沈平、彭于发、黄文胜、宛煜嵩。 本标准首次发布。  转基因植物及其产品成分检测 抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法 1 范围 本标准规定了转Bt基因抗虫水稻的定性PCR检测方法。 CaMV 35S启动子、NOS终止子、Bt基因的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本规范的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。 NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求 NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T674 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化SN/T1193-2003 基因检验实验室技术要求 SN/T1194-2003 植物及其产品中转基因成分检测 抽样和制样方法 3 术语和定义 gene 蔗糖磷酸合酶（Sucrose Phosphate Synthase）基因，在本标准中用作水稻内标准基因。 gos基因 gos gene 一个根部表达的水稻基因，在本标准中用作水稻内标准基因。 3.2 CaMV 35S启动子 CaMV 35S promoter 花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus）35S的启动子。 3.3 NOS终止子 NOS terminator 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti质粒胭脂碱合酶（nopaline synthase）基因的终止子。 3.4 cry1Ac基因 cry1Ac gene 编码苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因。 3.5 cry1Ab基因 cry1Ab gene 编码苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）Cry1Ab杀虫晶体蛋白的基因。 3.6 cry1Ab/cry1Ac融合基因 cry1Ab/cry1Ac fusion gene cry1Ab基因与cry1Ac基因经人工拼接形成的基因。 3.7 转Bt基因抗虫水稻 transgenic insect-resistant rice with Bt（Bacillus thuringiensis）gene 通过基因工程技术将外源cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因导入水稻而培育出的抗虫水稻。 3.8 Ct值Cycle threshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的时所经历的循环数。 根据转Bt基因抗虫水稻中CaMV 35S启动子、NOS终止子、cry1Ac基因或cry1Ab基因或cry1Ab/cry1Ac融合基因，以及水稻的内标准基因sps基因、gos基因，设计特异性引物/探针进行PCR扩增，以中是否含有基因。琼脂糖 5.2 溴化乙锭（EB）溶液：10 mg/mL 注：有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作。 10 mol/L 氢氧化钠NaOH）溶液160 mL水80 g NaOH，溶解后加水定容200 mL，塑料瓶中保存。 5.4 500 mmol/L EDTA溶液pH 8.0）：称取乙二铵四乙酸二钠Na2EDTA·2H2O) 18.6 g，加入70 mL水中，加入10 mol/L NaOH溶液，加热溶解后，冷却至室温，用10 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，水定容100 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。1 mol/L Tris-HCl溶液pH 8.0）：称取121.1 gTri