技术咨询电话：400-607-9999 一站式免疫印迹western blot套装 one .doc

一站式免疫印迹western blot套装 One-Stop Western Blotting Pack 货号: P030076 产品及特点Western Blot是检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫方法，又叫免疫印迹（immunoblotting）。该方法的是先将蛋白质从凝胶中转移到固相基质（硝酸纤维素膜）上；再对其进行特异性抗体检测。由于涉及多种溶液，用户单独配制的话十分繁琐，为此开发了本产品。它具有下列特点: 一站式，提供除水、样品和抗体以外的所有成分（检测方法有HRP或AP检测法两种）。 即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。 灵敏，可检测10 pg的蛋白质（HRP或AP检测法）。 灵活，与SDS、非变性PAGE胶、等电聚焦电泳等兼容。 规格及成分成份 A型 Western转移液 20 L（干粉） 硝酸纤维素膜（0.22μm） 20张 Western封膜液 0.2 L Western洗膜液 0.2 L Western抗体稀释液 0.2 L 热封塑料袋 20个 HRP显色试剂 20次 AP显色试剂 - 使用手册 1份 运输及保存常温运输，4℃保存，有效期一年。 使用方法一：转膜（湿法转移） 制备1L Western转移液并冷却到4℃。本产品以干粉形式提供，溶解在适量水中即得20×浓缩转移液(水的具体用量取决于是5L还是20L的包装),用时再用去离子水新鲜稀释20倍使用。 根据凝胶的大小剪切同样大小的滤纸和各边都大1mm的硝酸纤维素膜。剪切时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染硝酸纤维素膜。 将切好的硝酸纤维素膜浸泡在Western转移液中15-20分钟备用。注意：最好用镊子夹住膜的一边轻轻置于Western转移液上，使膜漂浮在转移液上，只有下层才与转移液接触，这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入转移液里，膜与转移液之间形成一层空气膜，这样会阻止膜与转移液接触。 在容器中将两块海绵垫、六层滤纸用转移液浸湿。 在转移夹上依次放上一张浸湿的海绵垫、三层浸湿的滤纸、一块凝胶（只要分离胶部分）、一张浸湿的硝酸纤维素膜、三层浸湿的滤纸、一张浸湿的海绵垫。注意：每叠加层一定要用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。膜两边的滤纸绝对不能相互接触，否则电转移时会发生短路，烧坏转膜装置。 合起转移夹并放入转移槽中（一定要注意方向，转印带负电荷的蛋白质时电极方向是膜正胶负；转印带正电荷的蛋白质时，电极方向是膜负胶正），然后用在第一步预冷的转移液灌满转移槽。 插上电极，一般在冷却条件下用100V恒压转移30-60分钟或冷室中14V转移过夜。 注意：一定要检查电流的大小，电流一般在0.1-0.4A。应根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝酸纤维素膜，即使白质已经转过了第一张膜，还会在第二张膜上检测到；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜。转移时间长的时候特别要注意加强降温措施。如果目的蛋白转移效率低，可以在转移液中加20%甲醇或0.1%的SDS。 终止转移后，取出膜，并在膜上剪去一个小角以标记方向。可用各种染膜液对胶或膜进行染色以确定蛋白质转移效率，或省略此步直接进入封膜步骤。 二：封膜 将膜转移至可以热密封的塑料袋中，加5-10mL Western封膜液，热密封塑料袋。 室温下脱色摇床上摇动封闭30-60分钟。 注意：此封膜液只适用于硝酸纤维素膜和PVDF膜，不能用于尼龙膜。 三：一抗结合 用抗体稀释液将一抗稀释至适当浓度。一般稀释10-100，000倍。 打热密封的塑料袋的一角，倒去封膜液，加入5mL一抗溶液，热密封塑料袋。 室温下脱色摇床上摇动封闭30-60分钟。 四：二抗结合 用抗体稀释液将二抗稀释至适当浓度，一般稀释500-4000倍。多余抗体可分装后放-20℃长期保存。 打热密封的塑料袋的一角，倒去封膜液，加入5mL二抗溶液，热密封塑料袋。 室温下脱色摇床上摇动封闭30-60分钟。过夜孵育可以提高灵敏度。 用洗膜液在容器中洗膜3次，每次10分钟。 根据二抗的标记物选择下面两种显色方法之一。 五：HRP显色检测（如果二抗是用HRP标记） 新鲜配制HRP显色液：将1mL HRP显色试剂溶液A、10mL HRP显色试剂溶液B、39mL洗膜液和33uL HRP显色试剂溶液C混合。 将硝酸纤维素膜转移到显色液中，摇晃5-30分钟显色。 显色后用水洗膜以终止显色反应，每次30分钟，共三次。 用吸水纸吸干膜上的水分，避光干燥保存或在一周内照相。 注意：本制品仅供研究使用，请勿用于临床治疗等其他用途