分子生物学实验常用实验技术 - 欢迎光临蚌埠医学院科研处.doc

分子生物学实验常用试剂配制 (1) 0.01M PBS缓冲液：一袋粉制PBS缓冲液加1000ml蒸馏水。(2) 0.01M枸橼酸盐缓冲液：一袋粉制枸橼酸盐缓冲液加1000ml蒸馏水。0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。(3)1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 (4) 1‰DEPC水：1mlDEPC加入1000ml新鲜三蒸水中，剧烈震荡20分钟使充分混匀，37oC至少放置2h或过夜，HIRAYAMA HV-50高压灭菌器高温高压30分钟降解DEPC，4℃保存。 () 1%琼脂糖凝胶：取琼脂糖0.2g置烧杯中，加入20ml的1×TAE缓冲液，封闭锥形瓶口，放入微波炉内加热，不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液，待琼脂糖全部熔化后取出摇匀，冷却至60℃左右，加入10mg/ml溴化乙锭（EB）1μl，EB的终浓度为0.5μg/ ml，充分混匀。将温热的凝胶倒入已经放好梳子的凝胶槽中，厚度约为3-5mm，注意不要有气泡，将凝胶放置室温待其自然凝固。凝固后从胶槽中轻轻取出梳子。(6)0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0加水至1000ml。(7) 50×TAE缓冲液：Tris碱242g，17.4mol/L冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA (PH 8.0)100ml加蒸馏水至1000ml。 () 30%储备胶溶液：溶解29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲基甲叉双丙烯酰胺于双蒸水中，搅拌至充分溶解后，定容至100ml。过滤后于4℃避光保存。 () 1.5mol/L(PH 8.8) Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调PH至8.8，最后用双蒸水定容至100ml。 (1) 1.0mol/L(PH 6.8) Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调PH至6.8，最后用双蒸水定容至100ml。 (1) 10% SDS：电泳级SDS 10g加双蒸水，68℃助溶，浓盐酸调PH至7.2，定容至100ml。 (1) 10%过硫酸铵（AP）：0.1gAP，加入双蒸水1ml，4℃保存一周。最好现用现配。 (1) 5×聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液（PH 8.3）：在900ml双蒸水，加入Tris碱15.2g，待溶解后，加甘氨酸94g，最后加SDS5g，盐酸调PH值到8.3，定容至1000ml。 (1) 2×SDS加样缓冲液：1mol/L Tris-HCL (PH= 6.8) 1ml，DTT 0.308g，10%SDS 4 ml，溴芬兰0.02g，甘油2ml，定容至10ml。置4℃避光保存或-20℃保存。 (1) 转膜缓冲液：双蒸水将甘氨酸2.9g，Tris5.8g和SDS 0.37g溶解后，加甲醇200ml，最后定容至1000ml。 (1) 0.01MTBS缓冲液：一袋粉制TBS缓冲液加1000ml双蒸水。 (1) 漂洗液（TBST缓冲液）：20%Tween1.65ml，加1‰TBS缓冲液700ml。 (1) 考马斯亮蓝G250染液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液中溶解G250马斯亮蓝0.25g，用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。 () 考马斯亮蓝洗脱液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液。 (2) 10×丽春红S染液：丽春红0.2g，三氯乙酸3g，磺基水杨酸 3g，加双蒸水至100ml。临用前稀释10倍。 (2) 丽春红S染液脱色液：0.01MTBS缓冲液. (2) 封闭液：脱脂奶粉(完达山牌) 5g，加TBST100ml。 由于本实验是检测细胞内mRNA，要防止RNA酶的污染，一旦污染会导致所检测的结果不准确，需要对实验所用材料、器皿等进行灭RNA酶处理。 实验中所用Eppendorf 管、移液头的处理：1‰DEPC水浸泡过夜，120℃高压蒸汽灭菌20分钟。70℃烤箱内烤干备用； 实验中所用玻璃器皿的处理：硫酸-重铬酸钾混合液中浸泡24小时，自来水充分冲洗，蒸馏水冲洗，1‰DEPC水浸泡过夜，120℃高压蒸汽灭菌20分钟； 实验中所用金属器皿清洗后，使用前一天经170℃干烤过夜；橡胶塞经清洗后，120℃高压蒸汽灭菌20分钟总RNA的提取（T法） (1) 加入1.0ml的T，用枪头抽吸混匀转移到无菌1.5ml Eppendorf 管中；