添加阿拉伯半乳聚糖或聚蔗糖对牛取样胚胎冷冻效果的研究.docVIP

添加阿拉伯半乳聚糖或聚蔗糖对牛取样胚胎冷冻效果的 韩伟，冯春涛2，毕江华2 ，陈龙1，刘潇1，裴燕2，余文莉2* （1.石家庄天泉良种奶牛有限公司，石家庄 050051；北京）通过将各种冷冻液的胚胎回收率、培养24h、培养48h发育率同对照组进行比较，得出最终结果，阿拉伯半乳聚糖系列冷冻液中，0.03EAS（86.05%vs93.62%、70.27%vs15.91%、81.08%vs22.73%）冷冻效果最好，聚蔗糖系列冷冻液中，0.6EFS（88.10%vs93.62%、64.86%vs15.91%、70.27%vs22.73%）冷冻效果最好关键词：取样胚胎；阿拉伯半乳聚糖；聚蔗糖；冷冻液 随着分子生物学的发展，现在已经能够成功鉴别动物附植前胚胎的性别，生产所需性别的动物后代。PCR技术鉴别牛胚胎性别时需要利用显微操作技术从桑葚胚或囊胚上切下一定数量的胚胎细胞用于PCR扩增反应，以鉴别Y染色体特异性DNA扩增片段，从而确定胚胎的性别，同时对切割取样后胚胎进行鲜胚移植或冷冻保存。Nowshari等，Snabes等，Kasai等，LeviSetti等，Zheng等，Chen等，对牛、鼠和人的胚胎、卵母细胞以及切割后的胚胎采用了不同的冷冻保护剂和方法成功进行了冷冻。然而，由于切割后透明带受到破坏、胚胎细胞数量减少以及细胞之间联系遭受损伤，造成切割取样后胚胎冷冻解冻成活率及移植妊娠率较低。本试验以常规乙二醇冷冻液为，添加阿拉伯半乳聚糖或聚蔗糖，研究在常规冷冻液中添加高分子量冷冻保护剂剂冷冻效果。 材料与方法 1.主要药品PBS（磷酸盐缓冲液HOLDING（胚胎保存液）：美国BIONICHE公司；EG FREEZE（乙二醇冷冻液Arabinogalactan（阿拉伯半乳聚糖美国Sigma公司Ficoll 70（聚蔗糖美国Sigma公司Sucrose（蔗糖美国Sigma公司BSA（牛血清白蛋白美国Hyclone公司YCD（PCR扩增液切割液回收液 1.2冷冻液配制。。。冰箱4℃静置，待用。胚胎取样 根据国际胚胎移植协会（IETA）制定的标准进行胚胎发育阶段和质量等级的评定。选择桑葚胚至扩张囊胚。对于桑葚胚切割卵裂球，对于囊胚切割滋养层细胞，若有游离散细胞，则切割散细胞，切下来的样品为5个细胞左右；样品放入装有8 μL超纯水的Eppendorf管(200 μL)中，待鉴定；胚胎回收到装有Holding液并编号的24孔平皿中，待冷冻。 本试验中采用常规快速冷冻，方法如下： ①程序为：-6 ℃植冰，降温速度为0.5 ℃/min，-35 ℃投入液氮。 ②装管，本试验采用六段法装管，先装入两段冷冻液，然后第三段装入胚胎，后面三段再装入冷冻液，最后塞入贴有标签的细管塞。(图1) 图1 胚胎冷冻装管示意图 Fig.1. picture of embryo cryopreservation ③胚胎放入冷冻液平衡5 min，装管后将细管放入已降温至-6 ℃的冷冻仪中并再次平衡5 min后植冰（植冰点见图1），植冰后按下RUN键（10 min后仪器开始以0.5 ℃/min的速度开始降温）；当冷冻仪温度降到-35 ℃时将细管投入液氮并液氮罐进行保存。 胚胎解冻 首先，将保温杯中水温调到～3℃，将装有胚胎的细管从液氮中取出，空气浴3秒钟，然后将细管塞端向下水浴约15秒钟；拿出细管用消毒纸巾擦拭干净，之后用75%的酒精棉球擦拭细管以对细管进行消毒，从第四段剪下有细管塞一端，另一端从两段棉塞中间剪开（见胚胎冷冻装管示意图1）；在φ35 mm的小平皿中滴少量Holding液，放在显微镜下，用推杆将胚胎从剪好的细管中推到Holding液中，用装有吸头的1 mL注射器把胚胎吸出，并放在滴有Holding液的六孔平皿中洗三次后，备用。 实验前一天晚上用φ35 mm平皿做好培养滴，每滴50 μL，滴好石蜡油后平衡，同时在培养箱中预热适量的操作液。将解冻的雄性胚胎用培养液洗涤3遍后放入培养滴中，每滴10~15枚胚胎，置于二氧化碳培养箱中培养，培养条件为38.5 ℃，100%湿度，5%CO2。24 h和48 h后分别观察、记录胚胎发育率。 胚胎解冻后从新装管进行胚胎移植操作。胚胎移植前对受体进行直肠触检，黄体合格者由技术熟练的技术人员将胚胎移植到受体有黄体一侧子宫角的上1/3～1/2 处。胚胎移植后45～60 d 对受体牛进行直肠妊检，确定妊娠结果。 1.6数据处理 将所得数据用软件进行统计分析。 结果 取样鲜胚冷冻-解冻-培养试验 如表所示，在胚胎回收率方面，只有0.04 EAS高于对照组FREEZE（95.56% vs 93.62%） (P0.05)，其余三种冷冻液中，0.6 EFS和0.03 EAS同对照组相比，差异不显著88.10% , 86.05% vs 93.62