包拉米虫检疫技术规范-检验检疫标准管理信息系统.DOC

前 言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国国检验检疫科学研究院、海南出入境检验检疫局 本标准主要起草人：刘建、林祥梅李丹丹朱振营、梅琳、本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1193 基因检验实验室技术要求下列缩略语适用于本标准。 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。 dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸。 dCTP：deoxycyticine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸。 dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸。 dUTP：deoxyuridine triphosphate，脱氧尿苷三磷酸。 bp：base pair，碱基对。 Taq酶：DNA聚合酶。 Tris?：tris（hydroxymethyl）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷。 TE：Tris-Cl、EDTA缓冲液。 B2M：beta2-microglobulin，贝塔2微球蛋白。 MT：mitochondial DNA，线粒体DNA。 NPTⅡ：neomycin-3′-phosphotransferase gene，新霉素-3′-磷酸转移酶基因。 CMV：cytomegalovirus，巨细胞病毒。 GFP：Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白。 SV40：Simian Vacuolating virus 40，猿猴空泡病毒40。 4 原理 样品经过提取DNA后，针对转基因动物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增外源基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分。 检测先对提取的DNA进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性，可判断含有转基因阳性。如果筛选基因为阴性则直接报告结果为转基因阴性。 检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T 1193中的规定执行。 5 试剂 5.1 PCR用引物 按照表1中提供的引物序列合成引物，加入无离子水配成100 pmol/μL贮存，配成直接用于PCR反应的10 pmol/μL的工作液。 表1 检测转基因动物内外基因所需的引物序列 被检测基因 基因来源 引物序列 扩增长度 备注 Cow B2M 内源 5′CCTGAACTGCTATGTGTATGG3′ 5′GTAGAAAGACCAGTCCTTGC 3′ 121 DNA提取效率检测 Cow MT 线粒体DNA 5′GCCATATACTCTCCTTGGTGACA3′ 5′GTAGGCTGGGGAATAGTACGA3′ 260 DNA提取效率检测 NPTⅡ 外源 5′CTATTCGGCTATGACTGG3′ 5′TGAGATGACAGGAGATCC3′ 263 筛选检测 CMV 外源 5′GTCATTAGTTCATAGCCCATA3′ 5′GCGGAGTTGTTACGACATTT3′ 464 筛选检测 SV40 PolyA 外源 5′TGTTTATTGCAGCTTATAATGG3′ 5′ACAAACCACAACTAGAATGC3′ 96 筛选检测 GFP 外源 5′TTCTTCAAGTCCGCCATG3′ 5′GTGTTCTGCTGGTAGTGG3′ 311 筛选检测 Pig MT 线粒体DNA 5′GCCATATACTCTCCTTGGTGACA3′ 5′GTAGGCTGGGGAATAGTACGA3′ 220 DNA提取效率检测 Sheep MT 线粒体DNA 5′TATTAGGCCTCCCCCTTGTT3′ 5′CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC3′ 295 DNA提取效率检测 药品及试剂 5.2.1 TaqDNA聚合酶，琼脂糖（电泳纯），溴化乙锭，三氯甲烷（氯仿），异丙醇，异戊醇，70%乙醇，分子量标准（100 bp～2000 bp）。 5.2.2 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 5.2.3 10×PCR缓冲液：100 mmol/L 氯化钾（KCl），160 mmol/L硫酸铵[（NH4）2SO4]，20 mmol/L 硫酸镁（MgSO4），200 mmol/L Tris-HCl（pH8.8），1 % TritonX-100，1 mg/mLBSA。 5.2.4 50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为：取Tris