血红蛋白的提取与分离16.pptVIP

思考 高温灭菌和酒精消毒分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？（ ） A、变性、变性、空间结构 B、分解、变性、化学结构 C、变性、变性、平面结构 D、分解、分解、空间结构 看书：64、65页，思考以下问题： 1、蛋白质分离的依据是什么？方法是什么？ 2凝胶色谱法分离蛋白的依据是什么？原理又是什么？其过程怎样？ 3缓冲液的作用是什么？如何配制？又有何实践意义？ 补充：蛋白质的性质 两性电解质：可表现酸性也可表现碱性，因为既含酸性基团——羧基，又含碱性基团——氨基 可溶于水，呈胶体状 盐析：向蛋白质溶液加高浓度无机盐，蛋白质以沉淀析出，再加水稀释，沉淀消失，蛋白质溶解。此过程可逆，不影响蛋白质性质 变性：强酸，强碱，高温，重金属作用下蛋白质的空间结构被破坏，蛋白质变性。 使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中?? （??? ） 第二课时  分离血红蛋白溶液 思考 为何使用PH=7的磷酸缓冲液中透析？为什么缓冲溶液的量远多于血红蛋白溶液量？ 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ） A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 ⑦样品处理液? 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油 ⑨脱色液? 10%的甲醇和10%的冰醋酸 ⑧染色液? 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸 1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行 注意事项： 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套 ① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备 （1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板 （2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备 用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2—3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液 3、电泳方法步骤 用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合 ②分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水 （3）样品处理　 ③配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液 （5）加样 在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100 ℃温度下加热3 min，以使蛋白质变性 按顺序加样，加样量通常为10—25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品 （4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源 （6）电泳 （7）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位 1、样品处理 (1)血液组成 （二）操作过程 思考 人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 本课题可以选用猪、牛、羊、等哺乳动物的血液 血液 血 浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 2条a－肽链 2条β一肽链 4个亚铁红素基团 ①血液组成 ①红细胞的洗涤 A、洗涤红细胞目的 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗