改良CTAB法提取番茄丝瓜葡萄(多糖型,纤维组织,腺毛组织多的样品)植物叶片,茎等部位基因组方法.docxVIP

CTAB法原理 ? CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)：是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。CTAB提取缓冲液的经典配方原理： ?Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中； ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 ? PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。二、实验程序主要试剂的配制 ?参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：?（1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。 ?（2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。 ?（3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。（4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。（5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。 ?（6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80 mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03× ?105Pa下灭菌20 min。4℃保存。（7）3 mo1/L NaAc·3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。4℃保存。 ?（8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2％β-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03×105Pa下灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。4℃保存。 ?（X）2X?CTAB提取DNA缓冲液配方?CTAB 4g?NaCl 16.364 g?1M Tris-HCl 20ml( PH8.0)?0.5M EDTA 8ml(PH8.0)?pvp 2% ?（使用时再加）?先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌。（9）裂解缓冲液（2%CTAB；100 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0；20 mmo1/LEDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇）100 mL：取10%CTAB 20?mL，加1mol/LTris～HC1(pH 8.0)10 mL，加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL，加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100mL，高压灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。 ?（11）TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1，pH 8.0；1 mmo1/L EDTA，pH 8.0)：取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL，EDTA(pH 8.0)0.2 mL，用双蒸水定容到100 mL，高压灭菌20 min。4℃保存。?（12）电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）的配制 ?50×TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0)，用双蒸水空容至1000 mL。 ?1×TAE电泳缓冲液的配制：取50×TAE 10 mL，再加入490 mL双蒸水，定容至500mL ? ? ? ? 参考方法?丝瓜DNA的提取与纯化 ?CTAB（十六烷