第六章质粒(质粒).pptVIP

第六章 质 粒 (plasmid) ;质粒对宿主细胞是非必需的，但在某些条件下，质粒能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。 如抗药性质粒和降解性质粒就能使宿主细胞在有相应药物或化学毒物的环境中生存。 质粒也像染色体一样携带编码多种遗传性状的基因，并授予宿主细胞一定的遗传特性，许多与医学、农业、工业和环境密切相关的重要细菌的特殊特征便是由质粒编码的，如植物结瘤、固氮、对有机物的代谢等。 ;在基因工程和分子生物学的发展过程中，质粒也起着非常重要的作用。以质粒为载体进行的基因克隆技术，以质粒为载体在原核生物和真核生物中表达外源蛋白的方法和技术已在工、农、医各个领域中得到广泛应用。 因此，对质粒的研究无论在理论上或应用上均具有十分重要的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。 ;第一节 质粒的发现和命名 ;二、质粒的命名原则 ;其规则是： 质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。 编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，如pUC18和pUC19等。;第二节 质粒的遗传特征; 质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（Stringent plasmid）和松弛型质粒（Relaxed plasmid）。 质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被称为严谨型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。 如F质粒，每个细胞中只有1-2个拷贝，它们的复制受到严格控制，属于严谨型质粒或低拷贝质粒。; 另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。 分子量小的CoLEl质粒，每个细胞中有10-100个拷贝，它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。 含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂受到抑制，染色体DNA也停止了复制，但所含的ColEl质粒可持续复制10~15小时，直到每一个细胞中含有1 000~3 000个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一类型的质粒。 控制拷贝数的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相互作用的结果。 ;类型 ;二、 质粒的复制 ;质 粒 ;质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向复制和双向复制两种类型。 革兰氏阴性细菌中多数质粒是以θ型方式复制，R1、R100等是单向复制，F、R6k等是双向复制类型。;质粒滚环复制示意图 ; 复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点——ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。 ; 将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。;质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒的寄主范围通常是由ori区决定的。有些质粒如ColEl类型的质粒，包括pBR322、pET和pUC具有较窄的寄主范围，这些质粒只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌(Klebsiella)中复制。;三、质粒复制的调控;1. 抑制物-靶位调控;1）ColE1质粒的复制调控;RNAⅡ也叫做复制引物。RNAⅡ分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RNaseH酶所切割，从而释放出3′-OH末端，作为供DNA聚合酶Ⅰ合成DNA的引物。 RNAⅡ前体的合成起始于其复制起点上游555bp处的启动子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约150个核苷酸附近的一个位点。此约750个核苷酸的起始转录物的5’端折叠成复杂的二级结构，从而使RNA产生一个富G环，后者与位于模板链复制起点上游20个核苷酸处的质粒DNA富C区正好匹配。随后，该RNA转录产物由RNaseH加工为成熟引物，其切割位点位于复制起点内5个A序列中。所得的555个核苷酸的成熟RNA II被DNA聚合酶I用作引物启动前导链的合成。;质粒DNA的复制过程 ;RNAⅠ是复制的负调节物 RNAⅠ可以通过同RNAⅡ结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。 colE1复制子不能影响质粒复