食管癌细胞株中Slug高表达对细胞转移的影响和机制研究.pdfVIP

潍坊医学院学报 2012年 第 34卷 第2期 9l 程中的作用已被提出并被深入研究。有研究报道， 蛋白的表达 将 Eca一109／pcDNA3．1，Eca一109／Slug细 Slug基因在多种恶性肿瘤 中存在 明显上调现象，Slug 胞培养48h后 ，按李艳等 方法检测细胞 内E—cadher— 上调的肿瘤更容易出现远处转移、浸润深度 的增加和 in和Vimentin蛋 白的表达 。应用 ImageJ软件对West． 较差的预后 J。后来发现，Slug在恶性肿瘤 中过度 ernblot结果的灰度值进行分析。 表达 ，且与肿瘤的发生、发展、疾病预后有关。本实验 1．7 Transwell细胞侵袭实验检测体外侵袭能力 取 通过转染真核表达载体pcDNA3．1．Slug的方法促使人 Transwell小室放入 24孔板内，将重组基质胶置于小室 食管癌细胞 Eca一109发生 EMT，进一步观察增强 Slug 滤膜的上方，基质胶层 由Matrigel胶 20 g组成，将细 基因对人食管癌细胞侵袭能力的影响，从而为临床筛 胞悬液 中的细胞以 1×10／cm。密度按每孔 200~1接 选药物提供理论和实验依据。 种于 transwell膜上，并在小室下方每孔加入 600lxl趋 1 材料和方法 化剂 ，即含 10％胎牛血清的RPMI1640培养基。常规 培养 48h取出Transwell小室，用棉拭子将微孔膜上层 1．1 材料 食管癌细胞株 Eca．109由我实验中心提 供，RPMI1640培养基购 自Hyclone公司；人锌指转录 的基质胶擦去，保留侵袭至微孔膜下面的细胞，4％多 聚 甲醛固定，HE染色，每组设 3个复孔 ，实验重复 3 因子 Slug全长 cDNA的pcDNA3．1载体在我实验 中心 次，显微镜下观察穿过基质膜底面的细胞数，以穿膜细 构建；AMV第一链 cDNA合成试剂盒和高保真PCR试 剂盒均购 自上海生工生物技术有限公司；脂质体转染 胞数表示肿瘤细胞的侵袭能力。 1．8 统计学处理 所有实验数据结果用均数 ±标准 试剂为 Invitrogen公司产品；引物由上海生工生物技术 差表示，采用 SPSS17．0软件分析数据 ，两组问比较采 有限公司合成；鼠抗人 E—cadherin和Vimentin多克隆 用独立样本 t检验 ，多组之间比较采用单因素方差分 抗体购 自SantaCruz公司；标记 FITC的羊抗 鼠二抗购 析，以P0．05表示差异有统计学意义。 自北京中杉生物技术有限公司。 1．2 pcDNA3．1．Slug载体的构建与鉴定 按 Trizol试 2 结果 剂盒说明提取细胞中的总RNA，AMV反转录酶合成第 2．1 重组 pcDNA3．1一Slug载体 的构建与鉴定 从 一 链 cDNA。PCR扩增 获得 Slug基 因片段，长约 Eca一109细胞中提取总 RNA，逆转录获得第一链 cD． 941bp，将其连接到已酶切好的pcDNA3．1(一)质粒上 NA，PCR扩增可获得特异性 Slug基 因片段，长约 构建pcDNA．Slug真核表达载体并进行酶切鉴定与测 941bp。胶 回收纯化后把该片段连接在 T载体上进行 序 。把重组质粒用脂质体 Lip2000转染到食管癌细胞 rr／A克隆，转化后抽提质粒进行酶切鉴定，取5 1进行 株 Eca．109进行后续实验。SlugPC