大鼠海马神经元原代培养方法.pdf

膜片钳技术系列手册（6） 大鼠海马神经元原代培养方法 刘 卫 吴丽颖 刘振伟 编写 （2015 年5 月31 日） 目 录 1. 简介 （2 ） 2. 实验条件与设备 （2 ） 2.1 实验室要求 （2 ） 2.2 仪器设备 （2 ） 2.3 常用工具与耗材 （2 ） 3. 实验动物 （3 ） 4. 实验试剂及配置 （3 ） 4.1 实验试剂 （3 ） 4.2 试剂配制 （3 ） 5. 实验操作 （4 ） 5.1 准备工作 （4 ） 5.2 剥离组织 （4 ） 5.3 消化和分散 （5 ） 5.4 细胞计数 （5 ） 5.5 存活率检测 （5 ） 5.6 细胞接种 （5 ） 5.7 更换培养液 （6 ） 6. 神经元形态观察 （6 ） 7. 免疫组化染色观察 （7 ） 8. 无血清培养 （7 ） 9. 注意事项 （8 ） 10. 膜片钳实验 （8 ） - 1 - info@ 1. 简介 神经元培养是二十世纪七十年代发展起来的一种组织培养技术。最早培养的是外周交感节神经元， 后来中枢神经元的培养也获得成功。1977 年，Banker GA 和 Cowan WM （Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 1977, 126: 397-425. ）首次报道了胚胎大鼠海马神经元的分散培养，为研究 单个神经元的生理功能和药物作用的细胞分子机制提供了良好的标本。至今，该技术已经成为众多生物 实验室的常规技术。 神经元培养技术的基本原理是，应用蛋白酶对需要培养的脑组织区域进行消化分散，获得单一细胞 悬液，在培养皿/瓶中进行接种培养。在这种体外培养过程中，神经元可从分散造成的损伤中完全恢复， 并生长发育为具有相对较完整形态结构和生理功能的神经元个体，同时神经元间还会形成交织成网状的 突触联系。 培养神经元作为良好的实验标本在生理学、神经生物学、分子生物学和药理学等学科中应用十分广 泛，在共聚焦显微技术、免疫化学和电生理技术中经常被使用。不仅可直接观察活细胞自然的形态和功 能发育，而且还可比较药物作用前后的变化。药物对神经元的影响还排除了血液、代谢产物和激素等各 种因素的干扰。 与急性分散的神经元标本相比，机械损伤对其造成的影响很小，其形态非常完整，突起较多，细胞 基本上处于比较自然的生长发育状态。然而，尽管其生存于模拟体内的特殊环境与条件下，与在体神经 元的环境相比仍存在很大差异，所以在对实验结果的分析上，不能简单地将其移植到在体的情况。 海马属大脑边缘系统，与情绪、学习记忆有关，它具有明显的产生突触传递长时程增强（LTP）和长 时程抑制（LTD）的能力。LTP 和LTD 目前被认为是学习记忆的基础。海马又是常引起癫痫发作的病变部 位，并且海马细胞对缺氧、缺血特别敏感。因此，海马成为研究脑功能与脑疾病的良好标本。 海马主要的细胞类型是锥体神经元，占海马全部神经元的90%左右。海马神经元培养获得的海马神 经元也多为锥体神经元，虽然也含有少量中间神经元和其它类型神经元。 本文介绍的是大鼠海马神经元常用的培养方法，大家在使用时应该掌握一般的普适原则，因实验条 件不同要学会变通。此外，本方法也可为培养其它神经元提供参考。 2. 实验条件与设备 2.1 实验室要求 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染，因此要求有独立无菌 的细胞培养间。细胞培养间内要配备常用设备，如紫外灯、倒置显微镜等。细胞培养间一般包括更衣间 （