蛋白质分子基础4-蛋白质制备2.pptVIP

双向电泳 双向电泳:由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。 1975年，O’Farrell首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白质组学的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。 PAGE电泳分离的大分子的检测 考马斯亮蓝染色法 可检出0.3~1ug的蛋白质。 银染色法 银离子与蛋白质以盐或配价络盐的形式结合，用甲醛将银离子还原为可见的银颗粒。可检测ng水平的蛋白质。 荧光染色技术 荧光合成物质与PAGE上的蛋白质发生反应，发出强烈的荧光，可检测到PAGE中的蛋白质。 免疫印迹法 蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 具体操作为经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，