液相色谱HPLC培训教程.pdf

高压液相色谱 HPLC 培训教程(一) sD 【字体：大 中 小】 I ．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定 相(stationary phase)发生作用 （吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同， 在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特 （Tswett ）在 1906 年研究用碳酸钙分离植物色素 时发现的，色谱法(Chromatography) 因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱 法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为 经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography ，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 6 年代后期引入了气相 色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有 高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography ，HPLC) 。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP) 。也称现代液相色谱。 二、HPLC 的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压-压力可达 150~3 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2 以上。 高速-流速为 0.1~10.0 ml/min 。 高效-可达 5 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达 1 种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达 0.01ng 。同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高-紫外检测器可达 0.01ng，荧光和电化学检测器可达 0.1pg 。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC) 。气相色谱法适用于分离 挥发性化合物。GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以 GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC 同样 可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC) 。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临 界流体 （界于气体和液体之间的一种物相）为流动相 （常用CO2 ），因其扩散系数大，能很 快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC， 又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC ）和亲和色谱法,此外还有电泳。按操 作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法 （正相与反 相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同 而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度 5~1 μm 。适用于分离分子量 2 ~1 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合 物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2 ．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原 理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过 程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体 表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起