GenEscortTMⅢ 使用说明 - 慧基生物.DOC

GenEscortTMⅢ 使用说明一．产品介绍GenEscortTM Ⅲ 是一种多用途的转染试剂，该试剂由可生物降解的超高分枝的PEI衍生物与其它组分复合而成。对各种贴壁细胞有较高的转染效率、也适用于转染悬浮细胞和原代细胞。可用于转染大分子DNA、小分子寡核苷酸和siRNA等。特别适用于携带质粒或DNA、RNA片段用于注射小鼠的静脉、皮下和腹腔等部位进行体内动物实验。GenEscortTM Ⅲ 与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势，主要表现为：????????? 对绝大多数贴壁细胞有较高的转染效率????????? 可用于转染原代细胞和悬浮细胞????????? 操作简单，结果重复性好????????? 转染试剂/DNA复合物的形成时间只需10-15min，可以在最短的时间内完成转染????????? 转染试剂/DNA复合物可以直接加入完全细胞培养基中，血清和抗生素不影响其转染效果????????? 细胞毒性低，转染前后不需要更换培养基，不用去除转染试剂????????? 需要较少的转染条件优化 ? 二．运输与储存运输：常温??? 储存：2－8℃?? 一年； －15℃至―20℃? 二年以上 ? 三．转染前的准备与注意事项 ? 1．细胞接种为了取得较高的转染效率，推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。要求在转染前24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。转染时细胞密度一般应为60-80%，但这因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株建议细胞密度为70-90%。以24孔板的转染为例，最理想条件是在转染前24小时，每孔接种(500 μl )0.5－2×105个细胞。在大多数情况下，如果在细胞贴壁后(接种几小时后)即进行转染，也可以得到相近的结果。表1列举了不同细胞培养装置的推荐细胞数量。 ? 2．DNA的质量为了取得较高的转染效率，推荐使用高纯度的质粒。仅仅根据DNA电泳条带的情况估计DNA的量和纯度是不够准确的。建议对提取的质粒DNA的量和纯度进行检测，DNA含量 (μg/mL)=50 × (260 nm的读数) × 稀释倍数，通过检测质粒DNA在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度，OD260/OD280值应该≥1.8。转染时不同品质的DNA用量不同，以24孔板转染为例，使用酚氯仿沉淀法提取的质粒DNA一般每孔需要加入≥2μg质粒DNA，而使用Qiagen分离柱或类似方法提取的质粒DNA一般每孔需要加入0.5-1μg质粒DNA。 ? ??????? ???????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????? ?表 1? 不同细胞培养装置转染前一天细胞接种的推荐细胞数量 细胞培养装置 接种细胞数量 每装置面积（cm2/孔或皿） 细胞培养液总体积 （每孔或每皿）* 96 孔板 10 000 - 30 000 0.3 0.1 ml - 0.2 ml 48 孔板 30 000 - 80 000 1 0.25 ml - 0.5 ml 24 孔板 50 000 -200 000 1.9 0.5 ml - 1 ml 12 孔板 80 000 - 400 000 3.8 1 ml - 2 ml 6 孔板/ 35 mm 培养皿 200 000 - 600 000 9.4 2 ml - 4 ml 60 mm 培养皿 400 000 - 800 000 28 5 ml - 10 ml 100 mm 培养皿 1 000 000 – 2 000 000 78.5 10 ml – 20 ml 140 mm 培养皿 2×106– 5×106 153 20 ml – 40 ml 为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积，转染 2－3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。 ? 3．血清的影响与大多数脂质体转染试剂不同的是，在转染过程中细胞培养基中包含血清反而可以提高转染效果。但是在GenEscortTM Ⅲ 和DNA形成转染复合物的过程中不能添加血清。转染复合物的制备过程中可以使用不含血清的培养基或细胞实验室常用的PBS稀释质粒DNA和转染试剂。4．GenEscortTM Ⅲ 的用量在体外细胞转染试验中，对于接种细胞密度在60%-90% 之间的实验样本，可通过预试验在GenEscortTM Ⅲ（μl）∶DNA（μg）= 2∶1 － 6∶1之间选择最佳的比例。对大多数细胞GenEscortTM Ⅲ（μl）∶DNA（μg）的推荐比例为2∶1。在动物体内转染试验中，动物肿瘤模型的建立