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六、高效液相色谱法 第一节 高效液相色谱仪 第二节 液相色谱中的固定相和流动相 一、液相色谱固定相 第三节 液相色谱法的主要类型 一、 液-固吸附色谱 二、 液-液分配色谱 三、 离子交换色谱 四、 离子色谱 五、 离子对色谱 六、 排阻色谱 2．荧光检测器 工作原理：利用某些试样具有荧光特性进行检测。 特点：高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 3．示差折光检测器 工作原理：折光指数与组成有关，连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 特点：通用型检测器； 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。 分类：偏转式、反射式和干涉型三种。 偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。 一、液相色谱固定相 二、液相色谱流动相 1．按固相材料的刚性程度分类 刚性固体 硅胶：用于液固色谱的固定相，液相色谱的担体，化学键合固定相基质材料。 硬质凝胶 聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成的多孔颗粒：只应用在离子交换色谱和凝胶色谱中。 2．按固相填料的疏松程度分类 薄壳型微珠载体（表面多孔型） 构成：30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶、多孔氧化铝或分子筛等，形成壳形结构。 特点：①多孔层厚度小、孔浅、柱效高； ②分配过程在载体表面进行，出峰快； ③颗粒大，装柱容易，适于常规分析 。 全多孔型载体 构成：硅胶、氟化铝或硅藻土的微粒凝聚而成多孔球体。 特点：颗粒较细，整个微粒全部是多孔性物质，表面积大，负荷量大。适合于复杂混合物分离和痕量分析。 二、液相色谱流动相 （1）称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 1.液相色谱流动相的特性 ①合适的溶解力与极性。 ②化学稳定性要好，与固定相和被测组分不发生化学反应。 ③与检测器相匹配。 ④溶剂的纯度要高。一般使用色谱纯试剂。 ⑤溶剂的流动性要好，黏度要低。 2.流动相应满足以下要求 3. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。 * 高效液相色谱法：以高压输出的液体为流动相的色谱技术。 High Performance Liquid Chromatograph HPLC 高效液相色谱法的特点 1. 高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色谱柱液； 2. 高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离； 3. 高灵敏度：采用高灵敏度的检测器; 4. 速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法所需的分析时间较少，一般少于 1h ； 5. 应用范围更广。 HPLC与GC的比较 相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。 不同点： 分析对象 GC： 适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品。占有机物的20%。 HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制， 适于溶解后能制成溶液的样品；分子量大、 难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品。 占有机物的80%以上。 流动相 GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar； 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。 HPLC： 流动相为液体； 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。 流动相种类较多，选择余地广。 GC：加温操作。 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。 操作条件 主要部件：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。 辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动进样装置、数据处理系统。 组成部件 基本流程 一、高压输液系统 包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置。 1．溶剂脱气装置 作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中的N2、O2进入检测器而使噪