细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍 - 天津灏洋.pdf

细胞载玻片爬片培养法进行免疫组化染色方法介绍 天津市灏洋生物制品科技有限责任公司 郑斌 徐彬 传统的细胞爬片中使用 24 孔板或 96 孔板，因为是塑料材质不利于抗原热 修复，而盖玻片较薄，易碎不容易取出，二者均存在一定的缺点。本实验采用体 外细胞载玻片爬片培养法，便于做热修复，同时操作较方便、简单、实用。 1 材料 1．1 载玻片的处理：用肥皂水将载玻片洗净，自来水冲洗，晾干，再将载玻片 浸泡在洗液中 2~3 小时，取出后再用自来水冲净，蒸馏水冲洗三遍，用干净的纱 布将载玻片擦干，放在饭盒中，置 170℃干烤 5 小时消毒灭菌。 1．2 人乳腺癌细胞系 T47-D、人骨肉瘤细胞系U2OS 。 1．3 仪器 倒置显微镜 、光学显微镜、二氧化碳培养箱、隔水式电热恒温培养箱等。 1．4 试剂 胎牛血清、DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、免疫组化试剂盒、无水乙醇、 抗葡萄糖转移酶（Glut-1 ）多克隆抗体、抗脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（APE1 ） 单克隆抗体、抗血管内皮生长因子（VEGF ）单克隆抗体、PBS(含 0.01M 磷酸 盐缓冲液，0.85%NaCl，pH 7.2~7.4) 、0.1 M 枸橼酸缓冲液（pH 6.2~6.4 ）、分化 液（10%乙醇、0.5%盐酸）、二甲基联苯胺（DAB ）等。 2 方法 2 ．1 细胞爬片培养 取人乳腺癌细胞系 T47-D 细胞及人骨肉瘤细胞系 U2OS 细胞各一瓶，用吸 管吸除培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入 2ml 0.25%胰蛋白酶,覆满瓶底。室温 放置 5 分钟后镜下观察，发现细胞变圆、细胞间隙增大后，立即终止消化，翻转 培养瓶，使瓶底向上。将胰蛋白酶吸去，加入约 2ml 含 10%胎牛血清的 DMEM 培 养基，将细胞从瓶壁上吹打下来，制成细胞悬液，滴于已处理好的载玻片上，每 张片子1~2滴，注意:滴于载玻片后 1/3 的位置，且不能有汽泡。放在 37℃ 5%CO2 培养箱中继续培养过夜。 2．2 细胞的固定 将已培养过夜的细胞爬片从 5%CO 培养箱取出，用 PBS 将培养液洗去，放 2 1 在冷乙醇中室温固定30分钟后，取出爬片放置在切片盒内-20℃储存，待免疫组 化染色。 2 ．3 免疫组化染色 将固定好的细胞爬片从-20℃冰箱中取出，室温放置约 10 分钟，用 PBS 室 温下洗3~5 分钟; 3% H O 室温封闭10分钟，消除内源性过氧化物酶，用PBS室 2 2 温下洗3~5 分钟;用 0.1M枸橼酸缓冲液微波中火修复10分钟;冷却后用PBS室温 下洗 3~5 分钟;正常山羊血清室温封闭 10 分钟，倾去，勿洗;每张片子分别滴加 相应的特异性抗 Glut-1 的多克隆抗体 、抗APE1 的单克隆抗体或抗VEGF 的单 克隆抗体各 50µl， 4℃过夜孵育;用 PBS 室温下洗 3~5 分钟; 滴加生物素标记山 羊抗鼠、山羊抗兔二抗 37℃孵育 30 分钟;用 PBS 室温下洗 3~5 分钟;滴加链霉卵 白素标记的辣根过氧化物酶,37℃孵育30分钟;用PBS室温下洗3~5 分钟; DAB显 色30分钟﹙1ml 蒸馏水+A 、B 液各一滴﹚,光学显微镜下观察至细胞内胞浆阳性 颜色与细胞外背景颜色对比度反差明显时，用蒸馏水终止反应。细胞核显棕黄色 颗粒为阳性反应；苏木素复染2分钟,胞核为蓝色;分化液分化，自来水返蓝; 依 次用80%、90%、无水乙醇、二甲苯脱水，每步需3~5分钟，中性树胶封片保留。 3 ．结果与讨论 通过免疫组化染色结果发现，Glut-1 在乳腺癌细胞系 T-47D 细胞主要在细胞 膜上表达（见图 1）。 APE1 在人骨肉瘤细胞系 U2OS 细胞的细胞核上和细胞质 中均有表达（见图2 ）。 VEGF 在人骨肉瘤细胞系 U2OS 细胞的细胞质中表达 （见 图3 ）。 图 1 T47D 细胞系 Glut-1 免疫组化染色 2