如何查找基因及设计因为PCR.ppt

基因查找，引物设计及Real-time PCR 庄群川 2013.11.18 Part one ---如何查找基因序列、mRNA The relationship of DNA,RNA,mRNA, cDNA, Protein 遗传学中心法责:DNA--RNA--PROTEIN! mRNA逆转录成为CDNA 总RNA包括tRNA,mRNA,snRNA,rRNA等  1.DNA是细胞核中的双螺旋结构脱氧核糖核酸链，储存着遗传信息。DNA包括内含子，外显子。 2.由DNA转录出各种RNA，RNA是单链的核糖核酸链。RNA包括mRNA，tRNA，rRNA，ncRNA。(ncRNA是none coding RNA 的简称，包括miRNA snRNA ,snoRNA ,scRNA,tmRNA等。) 3.mRNA从DNA转录出来后还要剪切掉内含子才可用来翻译蛋白质。 4.mRNA经反转录得到的DNA成为cDNA，因为cDNA没有内含子，所以和最初转录出mRNA的DNA不一样。 NCBI(National Center for Biotechnology Information)/ mRNA mRNA 同一个基因，可能存在不同的isoforms,mRNA序列有所不同，若没有特别要求，只需扩增到该基因的话，PCR引物可以选择扩增几个不同序列的公共保守区的序列。 Part two ---引物设计 参考影响因子高的文献上的引物序列或好的网站上的（注意种属！） 自行引物设计（软件） 普通PCR Real-time PCR 厂家设计合成（eg:Taqman 探针法） 普通PCR设计软件 Real-time PCR设计软件 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引物设计功能 。 打开程序首先进入的是序列编辑参看 Edit Primer 引物编辑窗口可以用来设计用于定点突变的引物或分析一条已有引物序列。进行粘贴时Paste 粘贴窗口会激活用以将引物序列转化为反向互补或反向互补形式您也可以手工键入引物序列一旦引物被编辑发生变化Analyze 按钮就可以使用点击Analyze 按钮即可分析编辑后的引物。 Automatic Search 自动搜索 参考影响因子高的文献上的引物序列或好的网站上的（注意种属！） 自行引物设计（软件） 普通PCR Real-time PCR 厂家设计合成（eg:Taqman 探针法） Real-time PCR Real time PCR 使用SYBR Dye 的话，对PCR 产物的特异性要求非常高。非特异产物主要是引物二聚体，它的多少可能决定了本实验的检测灵敏度。熔点曲线和电泳可以检测引物二聚体。SYBR 与所有dsDNA 结合，包括引物二聚体（Primer Dimers），这就会使结果偏大。如何消除引物二聚体并提高灵敏度？理想情况是引物设计非常完美，各种试剂的使用量恰到好处，温度变化与“变性，退火，延伸”完全吻合，使得PCR 过程中产生极少引物二聚体，极少有偏差的延伸，极少非目的模板的扩增。（1）设计适合Real time PCR 的引物。AppliedBiosystems 公司建议用Primer Press 软件来专门设计real time PCR 引物。一些常见的基因引物序列可以借鉴其他成功的研究者。（2）除了寻找合适的序列，还可以改变退火温度，限制引物的浓度。（3）减少配试剂到开始反应之间的非特异扩增。（缩短时间+冰上操作）（4）PCR 使用热启动酶，UNG 酶。 游离时无荧光信号 和DNA双链结合时，发出荧光 每次实验都必须同时扩增内参基因 * Part one ---如何查找基因序列、mRNA序列 Part two ---引物设计 Part three ---Real-time PCR 原理及应用 Part four(Discussing) ------从发现到分析,再到应用解决（临床问题） 这是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定搜索引物的范