实验5 琼脂糖凝胶电泳.ppt

琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 一 实验目的 学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 检测水稻总DNA的纯度与分子量 检测PCR的结果 二 实验原理 电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃ 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动 二 实验原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系 可依据DNA分子的大小使其分离 二 实验原理 Goodview可与DNA分子形成复合物，发射的荧光强度较游离的Goodview强度大10倍以上，且荧光强度与DAN含量成正比 示踪染料和分子量标准参照物 三 实验材料、用具及试剂 提取的水稻总DNA和PCR产物 电泳仪，电泳槽，电子水平，移液器，枪头，三角瓶、点样板，微波炉等 琼脂糖，TAE电泳缓冲液， Goodview，载样缓冲液（Loading buffer） 四、实验步骤 1 制胶： 100ml(0.5×TAE)+0.8g琼脂糖 三角瓶(1/3) 煮胶 溶解，冷却至60℃(不烫手)，加Goodview，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 四、实验步骤 2 点样： 5μl水稻总DNA+1μ2 loading buffer=7μl PCR产物+3μl loading buffer，混匀，吸取10μl 10μl ⅢMark DNA(λ DNA-HindⅢ ) 3 电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向 4 观察：紫外透射分析仪下观察，时间不要太久 五 注意事项 1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形 2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 4 Goodview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 5 紫外线照射不要太久 六 作业 画出电泳图，分析观察到的结果 * DNA分子在电泳条件下的迁移演示.exe M 1 2 3 4 PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳 *