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脂质体介导法转绿色荧光蛋白基因鸡的技术路线 研究 摘要 20多年前有人提出利用转基因动物合成治疗蛋白。现在生产转基因动物的方法和在奶 牛、绵羊、山羊的乳腺中特异性表达治疗蛋白取得了一定的进步。由于对转基因生物生产 的人类生物药品需求的日益增加，发展利用转基因家鸡输卵管作为生物反应器在蛋清中生 产外源蛋白显得尤为重要。在理论上转基因家禽较转基因哺乳动物具有不可比拟的优势， 但由于家禽胚胎发育的特殊性，迄今为止家禽的转基因技术还落后于该技术在哺乳动物中 的应用，为此我们进行了本研究。 研究目的:在SV40启动子的控制下，在家鸡囊胚细胞内导入和表达外源基因;对脂 质体//DNA的比例及DNA一脂质体复合物的注射剂量进行优化，从而推究出脂质体介导GFP 基因生产转基因嵌合体鸡的最佳技术路线，为转基因家鸡的生产提供一定的技术支持。 研究方法:本实验以白来航鸡种蛋为实验材料，体外分离鸡囊胚细胞并进行原代培养。 分别用1,2,3,4,5ug的DNA和6ul脂质体 (LIPOFECTAMINE2000)的混合物体外转染 来航鸡囊胚期原代细胞来优化质粒DNA(pEGFP-C1)和脂质体的最佳比例:用含1.5ug的 DNA一月旨质体复合物注射到新鲜种蛋的胚下腔;用荧光显微镜和PCR对胚胎和转基因鸡的各 个组织器官进行检测。 实验结果:当脂质体(ul)与DNA(ug)的比例为2:1时，其转染白来航鸡原代囊胚 细胞12h的效果最好，转染贴壁细胞数达20%;不做任何处理、只开窗不注射、注射培养基、 注射线性质粒DNA、注射脂质体一DNA复合物的种蛋孵化率分别为:91.67%,28.36%,13.67%, 25.49%,30%;对转基因鸡胚进行荧光检测时，在5日龄鸡胚中观察到了极少量的绿色荧 光，进行PCR检测时，检测到了5个阳性鸡胚，但是随着胚胎的发育，在后期没有出现阳 性结果。 实验结论:脂质体/DNA复合物为2:1时，转染贴壁白来航鸡原代囊胚细胞的效果最 佳。对种蛋的不同处理方法，破坏了种蛋原来的结构，导致孵化率显著降低，且不同处理 方法之间存在显著差异。对注射脂质体一NA复合物到囊胚腔进行孵化的种蛋进行荧光检测 和PCR检测，出现了阳性结果，说明外源DNA通过脂质体介导能导入鸡囊胚细胞。 关键词:鸡 囊胚细胞 脂质体 GFP脂质体一NA转基因 胚下腔 嵌合体 TheStudyofTechnologyRouteofTransgenic ChickenProducingwithLiposome-mediated GreenF!uorescentProteinGene Abstract Thepotentialofusingtransgenicanimalsforthesynthesisoftherapeuticproteinswas suggestedovertwentyyearsago.Considerableprogresshasbeenmadeindevelopingmethods fortheproductionoftransgenicanimalsandspecificallyintheexpressionoftherapeuticproteins inthemammaryglandsofcows,sheepandgoats.Increaseddemandfortheproductionofhuman biopharmaceuticalsintransgenicorganismshasledtoanintensiveefforttodevelopthehenasa bioreactorproducingexogenousproteinsineggwhiteviatransgenesis.Todate,however,robust methodsfortransgenicmodificationoftheaviangenomehavelaggedbehindinmammalian systems.Thepositivefeaturesassociatedwiththeuseof比.chickenintermsofcost,speedof developmentofaproductionflockandpotentiallyappropriateglyco