生物化学技术凝胶过滤.pptVIP

各组分间的 值差异越大，分离效果越好； 差异越小,则分离效果很差，或根本无法分离 流出物用部分收集器等量或等时收集，检测后分段合并相同组分的各管流出物，得到分子量不同的各种组分 1、当Kav=0时，则Ve=Vo ，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质全排阻，洗脱体积等于空隙体积即外水体积（图中组分Ⅰ） 2、当Kav=1时，Ve=Vo+Vi 。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内水体积之和。Ve=Vo+Vi （图中组分Ⅲ） 3、当0＜Kav＜1时，Ve=Vo+ Kav（Vi ＋ Vg ）。表示固定相中只有一部分可被组分扩散渗入，一部分被排阻，Ve即在Vo与Vo+Vi＋Vg之间变化（图中组分Ⅱ） 4、有时Kav＞1，表示凝胶对组分有吸附作用 （从内水中洗脱出来的含量下降），此时Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在Sephadex G-25中的洗脱体积远超出理论计算的最大值 二、 值的测定 只要测出 、 和 ，即可计算出 值 的测定：（1）计算法： （2）测定法： 的测定：用蓝色的葡聚糖2000（M=200万），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测（210、260或620nm）洗脱体积 的测定：用 、N-乙酰酪氨酸或其他小分子物质作为洗脱对象。由于分子量小，且无吸附，故洗脱体积刚好是 （ =1） 当分子大小在凝胶孔径的上、下限之间时，则 介于 和 之间（即 =0 ~ 1） 第三节 操 作 （一）凝胶的选择 1.型号：凝胶型号不一样，筛分范围亦不相同 如：Sephadex G 型多用于分离蛋白质； 生物胶和 Sephacryl等多用于分离核酸； 要除去蛋白质中的盐类，多用Sephadex G-25 2.粒度：粒度与交联度无关。与粗颗粒相比，细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均匀，分离效果好，但流速慢；而粗颗粒凝胶流速快，宜用小颗粒直径的层析柱 一、凝胶的选择与处理 （二）凝胶用量计算 由于凝胶在处理过程中会有一部分损失，故用此法计算出的凝胶用量需增加10~20% （三）凝胶的处理 将所用的干胶置于5~10倍量的D.W中，充分浸泡（表6-2溶胀时间），用倾斜法去除表面悬浮的小颗粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室温浸泡0.5h，抽滤除去碱液，用D.W洗至中性。再用抽气方法以D.W或平衡液除去凝胶颗粒之间的气泡 1．柱子的选择 ①当直径相同时，柱长长者比柱长短者分辨率高 ②柱长相同时，直径大者比小者分辨率高　　 ③床体积相同时，柱长长者比短的分辨率高 　　一般理想的层析柱直径与长度之比是1：25~1：100；层析柱外面最好有夹套，能控制温度（柱温箱） ，以保证结果的重复性 2．装柱：常用湿装法（第三章） 3．凝胶柱的鉴定 二、凝胶柱的制备 流速、柱长对分离的影响 加样量与层析柱床体积及检测方法的灵敏度有关。床体积越小、方法灵敏度越高时，加样量越少 　 层析的目的在于分析时，加样量占床体积的1～2％ ，作制备、脱盐用时，占20～30％ 　 一般来说，加样量越少，分辨率越高。具体加样体积由分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定 三、加样与洗脱 （一）加 样 　 VeA、VeB：组分A、B的洗脱体积 KavA、KavB：组分A、B的分配系数 　　 Vs：A、B两组分的洗脱体积之差（又称为分离体积）Vs= VeA － VeB 　　当样品体积Vp＝Vs时，理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开(图中Ⅲ)。但由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大 加样量（Vp）的确定 图Ⅱ、 Ⅲ中A、B两种物质有一定程度的交叉，这表明二者只是部分分开。因此，当Vp等于或大于Vs时，A、B两种物质就不能完全分开(图中Ⅱ) 　 当Vp＜Vs时，A、B两种物质就能分开(图中Ⅰ)　 根据 Ve = Vo + Kav（Vt － Vo） 又 Vs = VeA－VeB 　　　　　　　 = （ KavA－KavB ）（Vt － Vo） 　 Vs = （ KavA－KavB ）（Vt －Vo） 　　 = （ KavA－KavB ）（Vi +Vg） 　　　 A、B两种物质能分开的最低限：Vp＝Vs 最大Vs时的必要条件： 　①KavA－KavB 最大，为1－0＝1 　② Vi +Vg最大，一般为Vt/2 则：最大理论