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副溶血弧菌检测技术探究进展摘 要: 副溶血弧菌是一种革兰阴性嗜盐杆菌,是通过食用海鲜引起的腹泻疾病的重要病原之一。文章从传统检测技术、免疫学检测技术和PCR检测技术三个方面综述了副溶血弧菌检测技术最新研究进展。 关键词: 副溶血性弧菌; 检测; 基因; PCR技术 中图分类号: S944.4 文献标识码: A 文章编号:1009-8631(2010)04-0192-02 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP) 是革兰氏阴性嗜盐细菌, 隶属弧菌科中的弧菌属的一种人畜共患病菌。最早由Fujino等在1950年从日本1例食物中毒患者排泄物中初次分离得到,本菌呈弧型、杆型、丝状等多形态,菌体一端有单鞭毛,营养要求不高。副溶血性弧菌主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼虾、贝类等海产品中,是引起食源性疾病的主要病原之一。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后, 会引发人突发性食物中毒,可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。副溶血性弧菌还可导致海鲷、九孔鲍、斑节虾、对虾、牙鲆及文蛤等水产动物致病,间接影响人类的健康。 副溶血性弧菌在含3.5% NaCl培养基中最为适宜,无盐则不能生长,但当NaCl浓度高于8%时也不能生长。在盐浓度不适宜的培养基中,细菌呈长杆状或球杆状等多形态,无盐蛋白胨水中生长很差或不生长。在硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(thiosulfate-citrate-bile saltssucrose,TCBS)上副溶血性弧菌形成绿色菌落,能发酵葡萄糖、甘露醇产酸不产气,不发酵蔗糖和乳糖,分解色氨酸产生靛基质,神奈川试验(kanawaga phenomenen,KP)阳性。该菌不耐酸,不耐热,在1%醋酸或50%食醋中1min死亡,90℃1 min即被杀死。在淡水中存活不超过2d,在海水中可存活50d。副溶血性弧菌在普通血平板(含羊、兔或马等血液)上不溶血或只产生β-溶血。目前研究认为与副溶血性弧菌致病力相关的主要毒力因子为溶血素类,包括耐热直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin,TDH)、TDH-相关溶血素(TDH-related Hemolysin,TRH)和不耐热直接溶血素(Thermolabile Hemolysin,TLH)。国家食源性疾病监测网数据显示,我国微生物性食物中毒的病原分布发生了显著变化,特别是在沿海省份,副溶血性弧菌引起的食物中毒在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势,已经高居微生物性食物中毒首位。副溶血性弧菌检测在水产养殖疾病临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测、水产品进出口检测及医院感染监控等方面有着重要的作用。文章综述了副溶血性弧菌的各种检测技术手段。 一、常规方法 副溶血性弧菌的常规检测方法是传统的培养和生化鉴定方法。该方法也是目前食品中副溶血性弧菌检测的国家标准(GB/T 4789.7-2003)及行业标准。该方法是通过细菌形态特征、培养特性、生理生化特征来鉴定,包括培养增菌、分离提纯、镜检和生化试验及副溶血性弧菌的特有生化试验KP现象。具体的是采用氯化钠结晶紫增菌液进行增菌后、接种于氯化钠蔗糖琼脂和选择性琼脂平板使包括副溶血性弧菌在内的嗜盐性弧菌得以分离,可疑菌落经氯化钠三糖铁斜面、革兰氏染色和嗜盐性实验进行初步判定,最后经生化试验以及动物试验进行确定其是否为副溶血性弧菌,此方法只能定性不能定量。目前广泛使用的定量检测方法是FDA细菌分析手册中的最大可能数方法(Most Probable Number,MPN)。该方法将样品匀浆后在碱性蛋白胨盐增菌液(Alkaline peptone water,APW)增菌后,接种于TCBS分离该菌。但是最近Raghunath报道将以前方法改进后用牛磺胆酸钠培养(Sodium taurocholate,ST broth)检测海产品中的副溶血性弧菌优于APW法[1]。该方法耗时长,周期需要3~5d左右,操作繁琐、工作量大、人力物力花费大,给副溶血性弧菌的检测、研究、进出口贸易带来不便,不能满足食品卫生快速反应体系的需要。 二、免疫学检测技术 (一)免疫酶技术 将抗原抗体的特异性反应与酶的高效催化反应有机结合起来,通过酶降解底物呈现的颜色反应来指示特异性抗体的存在,根据反应颜色的深浅指示抗原量的多少。在多种免疫酶技术中以间接ELISA、双抗体ELISA以及Dot-ELISA法最为常用。酶联免疫吸附法(ELISA)与其他检测方法相比,具有特异性强、敏感性高、检测时间短、对设备的要求较低等优点,可以在短时间内准确地将副溶血性弧菌检测出来。已有类似报道集中在实验室方法探索上,余俊红等[2]建立间接EI1SA