食品酶学本(第三章酶的分离纯化第四节分离方法2).pptVIP

制作：赵效国 第三章 酶的分离纯化 概述 第一节 起始材料的选择 第二节 细胞破碎 第三节 酶的提取 第四节 分离方法 第五节 酶纯化步骤的设计及纯化效果的定量评价 复习题 分离方法分述 一、离心分离法 二、过滤与膜分离 三、沉淀分离法 四、层析分离法 五、电泳分离法 六、酶的结晶 七、浓缩与干燥 四、层析分离法 原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。 吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。 离子交换层析：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。 凝胶过滤层析：也称分子筛层析、凝胶过滤、排阻层析。是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。 亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的技术。 （一）吸附层析法 1、概念 吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中的各组分分离的方法。图 2、吸附剂 硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。例 一般在低pH值、低离子强度的条件下对酶进行吸附，而在提高pH值和增加离子强度的条件下，酶可解吸洗脱出来。3、吸附层析方法 ①吸附剂可装在吸附柱上进行吸附柱层析； ②把吸附剂加到酶液中，吸附后过滤出来，再加洗脱剂，使酶解吸而洗脱出来。 4、特点与应用 设备简单，操作容易，吸附剂来源丰富，价格低廉，又具有的一定的分辨率，是层析中应用最早，而且至今仍广泛应用的层析分离技术。 吸附层析法图 （二）离子交换层析 1、原理：依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离。 2、离子交换剂的构成：基质、功能基团（电荷基团）、反离子。羧甲基纤维素（CM-纤维素）：纤维素-O-CH2-COO-Na 反离子 基质 电荷基团 3、离子交换剂的种类 4、离子交换剂的选择 5、离子交换层析的操作流程 6、离子交换层析的应用：制备纯化生命物质：活性可保存、分辨率高、测定蛋白质的等电点。 离子交换原理图 3、离子交换剂的种类 亲水性离子交换剂 离子交换纤维素是以纤维素为母体引入活性基团而制成，亲水性能好，活性基团分布在纤维素表面，交换容量较大，是目前在酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、AE-纤维素、CMC（羧甲基纤维素）等。 离子交换凝胶是以葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为母体引入若干活性基团制成。这种离子交换剂同时具有离子交换和分子筛的作用，交换容量大，分辨能力强，在酶的分离纯化方面具有广阔的应用前景。常用的有DEAE葡聚糖凝胶、DEAE聚丙烯酰胺凝胶、DEAE琼脂糖凝胶、CM凝胶、SE（磺酸乙基）葡聚糖凝胶、SP（磺酸丙基）葡聚糖凝胶等。 常用离子交换介质 离子交换剂保存剂 4、离子交换剂的选择 强弱离子交换剂的选择： 强型：适用范围广，无离子水中或极端pH条件下稳定。 弱型：适用范围窄，适合分离生物大分子物质。 酶蛋白的pI为6- 9时，考虑用强型离子交换剂。 基质的选择： 分离有活性的生物大分子物质时，亲水性好于疏水性。 5、离子交换层析操作流程 ①离子交换剂可装成离子交换柱进行柱层析； ②可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。 离子交换柱层析主要操作过程： （1）离子交换剂的处理与装柱 （2）上柱 （3）洗脱和收集 （4）离子交换剂的再生 （1）离子交换剂的处理与装柱 ①预处理：浸泡与脱气 将干燥的离子交换剂用水浸泡2h以上，充分吸水膨胀后，减压抽除气泡，倾去水，用无离子水洗至澄清。再先后用4倍体积左右的2mol/L盐酸和2mol/L氢氧化钠浸泡各4h，再用无离子水洗至中性。 ②转型 经上述处理后的离子交换剂需经转型，使离子交换剂所带的可交换离子转变为适当的离子型。如阳离子交换剂用NaOH处理，转为Na+型；用HCl处理，转为H+型。阴离子交换剂用NaOH处理成OH-型；用HCl处理成Cl-型等。交换剂在使用后也需经转型，使之得以再生以重复使用。 ③装柱 转型后的离子交换剂小心地装进交换柱。装柱的好坏对分离效果有影响，要求装填得均匀，无气泡，无裂纹。装好后，保持液面在交换剂平面以上，防止空气进入。 （2）上柱 ①样品液的控制：上柱时要注意酶液的pH值、温度和离子强度等条件。 ②上柱：打开离子交换柱出口阀，让柱内液体慢慢流出。当液面刚好到达交换剂表面时，小心加进酶液，使酶液尽快均匀地分布于交换剂全表面，然后均匀进入交换剂层进行离子交换。继续加入酶液，直至交换