美味牛肝菌原生质体制备条件及再生能力探究.doc

美味牛肝菌原生质体制备条件及再生能力探究摘要：采用正交试验法探究美味牛肝菌原生质体制备条件，进一步研究其原生质体的再生能力，筛选出制备原生质的条件组合为：酶解时间：3h，混合酶浓度：1%纤维素酶+1%蜗牛酶，酶解温度：30℃，菌龄：4d；在原生质体制备率最高的条件下得出较高再生率的培养基为加富PDA培养基。 关键词：美味牛肝菌；原生质体；再生能力 中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2011）-03-0071-1 美味牛肝菌，夏秋季与林地上单生或散生，分布广泛，味鲜美，可食用，可药用，属优良的野生食药用真菌，与多种树木形成外生菌根。目前不能人工子实体栽培，其市场价格不菲，但目前对其研究很有限。 原生质体育种技术是最近几年发展起来的细胞工程育种新技术，这为珍惜是药用真菌的人工栽培开辟了新的育种途径，试验通过对美味牛肝菌原生质体制备的条件进行优化，使美味牛肝菌原生质体制备数目达到一个较高水平，为原生质体融合和转基因研究提供参考。 1 材料与方法 1.1 供试菌种 美味牛肝菌菌种有吉林农业科技学院食用菌研究所惠赠。 1.2 供试材料 1.2.1 实验试剂 蔗糖，甘露醇，MgSO4，KH2PO4，蜗牛酶，纤维素酶，葡萄糖，蛋白胨，琼脂，维生素B1，马铃薯。 1.2.2 培养基 PDA培养基；再生培养基：马铃薯综合培养基（一号），MYG培养基（二号），加富PDA培养基（三号）。 1.2.3 试剂的配制 用三重无菌水配制0.6mol/L MgSO4和0.6mol/L 甘露醇；酶液的配制：称取蜗牛酶，纤维素酶用0.6mol/L MgSO4 溶解制的混合酶液，经0.22um的滤膜过滤除菌。 1.3 试验方法 1.3.1 菌丝体培养 把保藏菌种复壮扩繁，28℃、180r/min液体培培养1-6d，将培养好的菌丝体置于无菌擦镜纸上，过滤，无菌水，渗透压稳定剂各冲洗2次，称重，按每100mg湿菌丝体加1ml混合酶液，酶解一定时间，用血球计数板计算原生质体的数目，用4层无菌擦镜纸过滤酶解液，将滤液3000r/min离心10min，沉淀用渗透压稳定剂洗涤2次，得纯化原生质体悬浮于0.6mol/LMgSO4中，用血球计数板计数。 1.3.2 原生质体的再生 把在不同实验条件下制备得到的原生质体，接种到再生培养基中，28℃培养观察原生质体的再生情况，原生质体的再生率采用平皿菌落计数法计算。 2 原生质体制备优化及再生条件的选择 采用L9(34)正交试验法，筛选制备美味牛肝菌原生质体的优化条件组合；选择原生质体制备率最高的原生质体接种到不同的再生培养基上，计算菌落的再生率，从而确定原生质体再生率最高的培养基。 2.1 原生质体制备实验条件的选择 酶解时间：2.5h，3.0 h ，4.0 h三个酶解时间；酶解温度：设置30℃、32℃、34℃三种的酶解温度进行试验；菌龄选择：分别选用3-5d菌龄；混合酶浓度：设置0.5%L+0.5%S，1%L+1%S，1.5%L+1.5%S 三个混合酶浓度进行试验（L:纤维素，S:蜗牛酶）。 2.2 再生条件 实验设置三种不同的再生培养基，分别是马铃薯综合培养基，MYG培养基，加富PDA培养基。 3 结果分析 3.1 原生质体制备优化条件正交试验结果 根据设置的实验条件，将酶解得渗透压稳定剂选为0.6mol/L的MgSO4，选择4个因素的三个水平作为制备原生质体的实验条件进行L9(34)正交试验。 表1 正交试验结果 L9(34)　　 3.2 正交结果分析 3.2.1 原生质体制备的实验结果 分析上表R值，RCRDRBRA，可知影响美味牛肝菌原生质体制备率的因素依次为：菌龄、酶解时间、酶解温度、混合酶的浓度；制备率最高的试验条件组合为A2B1C2D3。 3.2.2 原生质体再生能力的试验结果 用正交试验中原生质体制备率最高的试验4号制得的原生质体接种到一号、二号、三号培养基中，结果4-5d后平皿上开始出现菌落，成星芒状。原生质体在各培养基冲再生率：一号再生培养基上4.1%，二号再生培养基2.8%，三号再生培养基上最高为6.9%，分析3种再生培养基上原生质体的再生率和配方，可知，营养较丰富的培养基上原生质体的再生率较高。 综合以上试验结果可知，美味牛肝菌原生质体制备条件的优化组合为A2B1C2D3，菌龄为4d，酶解温度温度为30℃，酶解时间为4h，混合酶浓度为1%纤维素酶+1%蜗牛酶；美味牛肝菌原生质体再生率较高的培养基为加富PDA培养基。 1