蚯蚓抗菌肽提取及其活性探究.doc

蚯蚓抗菌肽提取及其活性探究摘 要： 以野生蚯蚓为原料，用磷酸盐缓冲液浸提，经高速冷冻离心机粗提和Sephadex G-75分离得到多肽，并通过对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑菌试验，实验结果表明：分离出的分子量较小的蚯蚓抗菌肽对大肠杆菌有较强的抑制性，而对枯草芽孢杆菌的抑制性相对较弱。 关键词： 蚯蚓； Sephadex G-75； 大肠杆菌； 枯草芽孢 中图分类号： Q501 文献标识码： A 文章编号： 1009-8631（2011）05-0174-02 引言 抗菌肽是一类具有热稳定性的碱性小肽[1]，分子量小，约为4 kDa，等电点为8.9～10.7，最初是从西枯比天蚕中分离的，后来又从其它昆虫中分离出不同类别的抗菌肽。天然的抗菌肽是昆虫免疫系统血淋巴中的一类抗菌多肽，人工合成的抗菌肽是通过基因工程或诱导的方法分离提纯而获得的。这些抗菌肽具有同样的特征：N端富含带有极性氨基酸，呈强碱性；C端为中性疏水性。抗菌肽具有的广谱抗微生物活性[2]，不仅能杀死细菌、真菌、原虫等病原微生物，抑制病毒的繁殖与扩散，而且也能杀死癌细胞[3]。其最小抑制浓度(MIC)为 0.25g/m～4g/ml。特别对一些耐药菌，如伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等也同样敏感[4]。 蚯蚓，特别是用于人工饲养和处理生活垃圾等废弃物的蚯蚓，生活在充满各种微生物[5]，甚至大量致病微生物的环境中，因此其必然有经过长期进化而形成的抵抗外来微生物侵袭的机制，对此进行研究，亦应具有潜在的理论和应用价值。 1试验 1.1原料与设备 蚯蚓，天然野生蚯蚓；大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，院动科实验室；葡聚糖凝胶，上海市长征制药厂；培养基，LB培养基；超声波细胞粉碎仪，JY92-2D型；台式高速冷冻离心机，TGL-16G型。 1.2试验方法 1.2.1蚯蚓抗菌肽的提取分离 取新鲜的蚯蚓50条，在水中浸泡24h，使其吐出肠道中的泥沙等异物[6]，用水洗干净后，加入2倍体积的0.2mol/L、pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液，用高速组织捣碎机捣碎，然后用超声波细胞破碎仪破碎，破碎时将装有待破碎蚯蚓的容器埋入冰中，用以散热，防止因过热而导致蛋白质变性，每次工作2秒、休息3秒，破碎20次，功率由0w逐渐升到600w。破碎后真空抽滤，收取含蚯蚓抗菌肽的过滤液并保存在保温瓶中，以备再用。 1.2.2抗菌肽的粗分离 将等质量的粗提液分装在离心试管中，在冷冻离心机内的温度保持在0℃～8℃条件下，于4℃开始高速冷冻离心分离，转速由0r/min逐渐升到10 000r/min，定时20min。用移液枪取离心后的上清液，放入盛有冰块的保温桶内，以备上样。 1.2.3葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）柱层析 （1）装柱和上样：取一定量的葡聚糖凝胶（Sephadex G-75），在水中充分溶胀24 h后，采用湿法装柱；装好的层析柱，至少要用3倍于层析床体积的0.2mol/L乙酸铵洗脱液平衡，待液面在床表面上1 mm～2mm时，关闭出口，距床表面上1cm沿柱壁圆周将样品注入，加样量为床体积的10%～15%；加完样打开出口，使样品完全渗入层析床；最后在柱床上面覆一薄层脱脂棉，以保护柱床表面，并且加样时，样品溶液的体积要小，尽量浓，这样流出的峰形好。 （2）洗脱和收集：洗脱时选用乙酸铵为洗脱液，凝胶柱装好后洗脱液洗脱到出现基线，然后进行梯度洗脱，每20min收集一管，为6 ml；将收集得到的样品放入冰箱中冷冻保存，并用平板打孔法对所收集的各管样品做抑菌活性测试。 1.3抗菌肽检测 （1）平板打孔法测抑菌性：以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为受抑菌，普通琼脂培养基为菌体培养基。按要求打孔[7]，以便利于观察。用无菌吸管吸取菌液注入平板后，并均匀涂布[8]，在37℃下培养12h～18h，观察抑菌效果。 （2）紫外光谱吸收：将测试有抑菌性的样品[9]，按照相应（V样品：V乙酸铵=1：6）比例进行稀释，在紫外区进行紫外吸收光谱的测定，并记下最大吸收峰处的波长和吸光度，并观察其峰形。 2 结果与分析 2.1乙酸铵洗脱液浓度的选择 为了提取蚯蚓中可能的有效抗菌肽，乙酸铵洗脱液的浓度从0.2 mol/L～1.0mol/L，对收集的样品进行抑菌试验，选择一个最佳的乙酸铵浓度。试验结果表明，该浓度区间洗脱的样品对大肠杆菌均有不同的抑菌作用，其中0.2mol/L下的效果较好，选取0.2mol/L为最佳浓度。 2.2 粗提液中抗菌肽的抑菌效果 为研究蚯蚓抗菌肽的作用效果，以及优化选择试验菌种，首先研究了粗提液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果[10]，并利用磷酸盐缓冲液对大肠杆菌的抑菌试验验证了蚯蚓抗