结核分枝杆菌erp蛋白pglts的4基序突变体的构建 - 江苏农业科学.pdf

江苏农业科学　２０１６年第４４卷第７期 — ３１— 郝秀静，马　超，李　敏，等．结核分枝杆菌Ｅｒｐ蛋白ＰＧＬＴＳ的４基序突变体的构建［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（７）：３１－３４． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．０７．００８ 结核分枝杆菌Ｅｒｐ蛋白ＰＧＬＴＳ的４基序突变体的构建 郝秀静，马　超，李　敏，赵　东，马佳丽 （西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室／宁夏大学，宁夏银川７５００２１） 　　摘要：以结核分枝杆菌Ｈ３７ＲａＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增，获得靶基因ｅｒｐ片段。采用重叠延伸ＰＣＲ的方法得到 ｅｒｐ基因ＰＧＬＴＳ的４基序的突变体，依次删除突变体的Ｃ－末端、Ｎ－末端和Ｃ／Ｎ－端，构建重组质粒ｐＥＴ２８ａ－Ｃ、 ４ ｐＥＴ２８ａ－Ｎ、ｐＥＴ２８ａ－ＣＮ，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ。对重组菌株ＩＰＴＧ诱导后的表达产物进行ＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳ－ＰＡＧＥ，得 ４ ４ 到大小分别约为１１．２、１５．４、４．８ｋｕ的目的蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ分析结果表明，目的蛋白表达特异。 　　关键词：结核分枝杆菌；重复输出蛋白；重叠延伸ＰＣＲ；ＰＧＬＴＳ；原核表达 　　中图分类号：Ｓ８５５．２　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）０７－００３１－０３ 　　牛结核病是影响养牛业最为严重的疫病之一，且该病为 １　材料与方法 人畜共患传染病，既造成了极大的经济损失还严重威胁着人 类健康，其主要致病菌为牛结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ １．１　材料 ［１］ 结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ、大肠杆菌ＤＨ（５）和质粒ｐＥＴ２８ａ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） 。重复输出蛋白（ｅｘｐｏｒｔｅｄｒｅｐｅａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ， α ［２］ （＋）由西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室保 ＥＲＰ）是牛结核分枝杆菌上的一个重要毒力因子 ，别称 Ｐ３６、Ｐｉｒｇ或Ｒｖ３８１０，它是一种分泌蛋白，存在于结核分枝杆 存，ＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｐ购自Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ公司。 菌复合体所有成员（结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌、非洲 １．２　试剂与仪器 ［３］ 限制性核酸内切酶Ｈｉｎｄ 、Ｋｐｎ 、Ｘｈｏ ，ＴＤＮＡ连接 分枝杆菌、卡介苗和田鼠分枝杆菌）中 ，而在其他细菌种内 Ⅲ Ⅰ Ⅰ ４ 没有发现同族体，使得Ｅｒｐ成为结核分枝杆菌家族的一个特 酶和ＷｉｚａｒｄＰＣＲｐｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ为Ｐｒｏｍｅｒｇａ公 异信号分子。ＥＲＰ蛋白全长为２８４个氨基酸，由３个不同区 司产品；ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒、ＰｆｕＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂 域组成，其中１～２２个氨基酸是信号肽序列，中心是基于 盒、ＨＲＰ－ＤＡＢ底物显色试剂盒、Ｄ２０００等 ＤＮＡｍａｒｋｅｒ、 ［４］ ＰＧＬＴＳ基序的１２个重复区 ，Ｎ－末端结构域（氨基酸 １～ １００ｋｕ等预染蛋白质ｍａｒｋｅｒ为天根生化科技（北京）有限公 ８０）和Ｃ－末端结构域（氨基酸 １７６～２８４）高度保守。Ｎ－末 司产品；ＩＰＴＧ、Ｘ－Ｇａｌ、氯霉素、氨苄青霉素购自Ｓｉｇｍａ公司； 端含有运送Ｅｒｐ通过质膜的信号肽序列，由２２个氨基酸组