鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估 - 中国科学.pdf

中国科学 C 辑:生命科学 2007 年 第37 卷 第6 期: 601~608 SCIENCE IN CHINA PRESS 鼠肝质膜蛋白质组研究的方法评估 † † 陈 平 张丽军 李选文 王细娥 曹 锐 刘 珍 熊继先 彭 霞 魏颖娟 银兴峰 王贤纯 梁宋平* (湖南师范大学生命科学学院, 长沙 410081) 摘要 细胞质膜是细胞中重要的细胞器, 在肝功能的发挥中具有非常重要的作用. 使用蔗糖密 度梯度离心纯化细胞质膜, 通过电子显微镜观察和免疫印迹法检验膜的纯度. 结果显示, 与组织 匀浆成分相比, 质膜富集了 20 倍, 线粒体的污染减少了约 50%. 提取的蛋白质用二/ 一维凝胶电 泳(2DE/1DE)分离、胰酶酶解、电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)和基质辅助激光解吸飞行 时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)鉴定, 或者提取的蛋白质直接进行溶液内酶解、液相色谱串联 电喷雾离子阱质谱(LC-LTQ)(鸟枪法)鉴定. 一共鉴定了547 个非冗余蛋白质, 其中34%为质膜或 质膜相关蛋白质. 优化和评估了质膜蛋白质组研究的方法, 且对鼠肝质膜蛋白质组进行了系统的 分析. 关键词 肝 细胞质膜 蛋白质组 质谱 2DE 鸟枪法 1DE 肝脏是人类最大的器官, 它的复杂性仅次于大 究. 细胞质膜通过蔗糖密度梯度离心, 用 3 种不同的 脑, 肝病(如各种肝炎及肝癌等)仍然是现代医疗的巨 方法(2DE-MS/MS, 1DE-LC-MS/MS 和鸟枪法)来分离 大挑战. 为了解决这些问题, 中国科学家牵头启动了 鉴定蛋白质. 一共鉴定了 547 个非冗余蛋白质, 其 人类肝脏蛋白质组计划(HLPP), 包括对肝脏蛋白质 中, 34%为质膜或质膜相关蛋白质. 组的研究[1,2]. 为了能最大限度地利用人肝组织, 中 1 材料和方法 国科学家决定先用C57 小鼠肝脏进行蛋白质组方法 学研究. 1.1 材料 在绝大多数真核细胞中, 约有 1 万多种蛋白质, 电泳试剂购自GE生物公司(Uppsala, Sweden)和 5 6 它们有 10 ~10 的浓度差. 因此当用全细胞为材料时 Bio-Rad 公司(Hercules, California, USA). NADH ubi- 通常很难得到中、低丰度的蛋白质. 为此, 很多研究 quinol oxydoreductase 39 单抗, catalase单抗, Golgi 97 者转向亚细胞的蛋白质组研究[3,4]. 细胞质膜是细胞 单抗和辣根过氧化物酶偶连的二抗购自BD 公司; 小 与外界接触的界面, 参与各种细胞调节活动, 是现有 窝蛋白的单克隆抗体(Anti-caveolin monoclonal anti- 三分之二药物靶标所在位置. 因此, 质膜蛋白质组研 + + body)和Na /K -ATPase 的抗体(Anti-Sodium Potassium [5~8] 究是亚细胞蛋白质组研究的焦点