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Western Blot （一） 细胞总蛋白的提取及聚丙烯酰胺凝胶的制备 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 王松梅 021 smwang2@fudan.edu.cn •1 一、实验目的 1. 掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质 2. 掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理 3. 掌握SDS分离蛋白质的原理和制胶操作技术 •2 Western Blot 的过程 HL60细胞 本次实验内容 聚丙烯酰胺凝胶的制备 总蛋白质制备 细胞裂解 蛋白质溶液 SDS分离蛋白质 SDS-蛋白质复合物 蛋白分离形成条带 蛋白质 转膜 凝胶 PVDF膜 1. 封闭 2. 一抗结合 在PVDF膜上鉴定c-myc蛋白 3. 酶标二抗结合 4. 显色 •3 二、实验原理 1. 细胞总蛋白的制备(SDS裂解法) 2. SDS电泳(不连续系统) 3. 转膜(半干转移法) 4. 在PVDF膜上鉴定蛋白质(抗原-抗体反应) •4 细胞总蛋白的制备 从细胞中提取出蛋白质的方法： 1)机械破碎：匀浆器，超声波，石英砂 2)去污剂：SDS，NP-40等 3)酶消化法：溶菌酶，纤维素酶 4)其他：高压挤压，反复冻融 从组织中提取蛋白质： 剪成小块，液氮中研磨，去污剂中溶解 •5 Lowry法测定蛋白质浓度（Folin-酚试剂） 1）蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋 白质-铜复合物 2）紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和 磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关， 分光光度计测吸光度，做标准曲线 •6 三、电泳槽 垂直电泳槽 •7 本体 制胶器 玻璃板