luxs基因敲除临床分离大肠杆菌株生物膜形成能力 - 第三军医大学学报.doc

luxS基因大肠杆菌株生物膜形成400038 ［摘要］ 目的：探讨LuxS 基因对临床分离大肠杆菌生物膜形成能力的影响；方法：构建LuxS 基因缺失的临床分离大肠杆菌，采用96孔板结晶紫染色法分析LuxS 基因缺失株生物膜形成能力的差异；结果：LuxS 基因缺失株生物膜形成能力减弱；结论：LuxS 基因对细菌生物膜的形成具有重要调控作用。 ［关键词］ 大肠杆菌；LuxS 基因；生物膜；基因敲除 luxS mutant of clinical isolatded Escherichia coli exhibits a changed biofilm forming capability Sun Fengjun?* Wang Qian Sh ihuiqing Xia Peiyuan# pharmacy department of Southwest Hospital,400038,chongqing china [Abstract] Objective：To explore if luxS knock-out mutant of Escherichia coli have effect．Methods：linical isolated Escherichia coli E17 was knocked out, and screening of biofilm was observed in 96 well plates with crystal violet. Results： strain, the biofilm forming capability of luxS mutant strain decrease. Conclusion: The luxS gene is important to regulate biofilm forming of Escherichia coli. Key words: Escherichia coli; luxS gene; Biofilm; gene knock-out Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China ? 基金项目：国家自然科学基金 *作者简介：孙凤军，男，药师，主要从事细菌耐药性方面的研究。E-mail:c #通信作者：夏培元，电话：（023E－mail：py_xia@大肠杆菌是临床分离率最高的革兰阴性菌，生物膜感染的常见病原菌，细菌感染形成生物膜后，可以发挥协同作用，形成复杂有序的立体结构，逃避免疫系统攻击，具有较高程度的耐药性，并可在生物膜解离后播散，导致其他系统的感染，生物膜感染的治疗已成为临床亟待解决的难题[1]。研究发现luxS-AI-2是关键的群体感应系统，广泛分布于革兰阳性菌和阴性菌中，可调节链球菌、李斯特菌等菌株生物膜的形成[2-4]，而大肠杆菌luxS-AI-2系统对细菌生长和毒素释放等具有调节作用[5]，为研究luxS-AI-2在大肠杆菌生物膜形成过程中的作用，本研究构建大肠杆菌luxS基因缺失株，并分析其细菌生物膜形成能力的变化。 1．实验材料 1.1菌株与试剂 携有kan抗性基因的pEGFP-N1质粒菌由西南医院烧伤科唐辉博士馈赠；。细菌基因组DNA抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒购自北京天根公司；T载体pAT2，KOD plus DNA 聚合酶、dNTP、限制性内切酶(BamH I和XhoⅠ)和逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司，T4DNA 连接酶、限制性内切酶(EcoRⅠBamH I、NdeI、Hind III和XhoⅠ)购自大连TAKARA公司；琼脂糖为西班牙进口分装；蛋白胨、酵母提取物购于英国OXOID公司；引物设计和测序由上海生工生物有限公司完成。2．方法 2.1 pAT2-kan质粒的构建 根据pEGFP-N1质粒说明书设计引物扩增完整的卡那抗性基因，引物序列参见表，PCR扩增卡那霉素抗性基因片段包括启动子共1293bp(2136-3428)。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳。纯化回收后加入相同体积的PCR mix，72℃加A尾20min，回收紫外分光度计测浓度，按照回收产物∶T载体pAT2的比例为3∶1的比例混合，16℃连接后转化感受态大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选，挑取单菌落增菌后提取质粒，EcoRⅠ酶切电泳鉴定，送上海生工生物有限公司测序。表-1 luxS上、下游序列和Kana霉素抗性基因引物序列 luxS上游序列 saence P1：5’-GGATCC CGCTGTATCGTGAAGGGCTGAA-3 阴