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バイオセンシング研究領域 （生体制御シグナル） 佐 藤 幸 治（特任准教授） １）専門領域：感覚生理学，細胞計測工学 ２）研究課題：ａ） 光を利用した細胞内カルシウムシグナル伝達経路の制御法の開発ｂ） 微小加工技術を利 用した，生体機能の再現に関する研究 ３）研究活動の概略と主な成果： ａ） 近年，光を利用して細胞内部で起こる生体反応を制御する，オプトジェネティクスと言われる実験技術 を利用して，生体機能を解析する研究が盛んになっている。オプトジェネティクスでは主に細胞内のナトリ ウムイオン濃度を制御することで，細胞内電位が関わる分子機構を操作する。しかし，細胞機能にはナトリ ウムだけでなくカルシウムも重要な役割を担っているが，光により高効率で細胞内カルシウム濃度を制御す る手法は開発されていなかった。 Orai1 は細胞内カルシウム濃度の制御に関わる，主要なイオンチャネルである。Orai1 は小胞体内腔のカ ルシウム濃度の低下を検知した STIM1 により，活性化される。そこで光によりコンフォーメーション変化 を起こす植物由来の LOV2 と STIM1 のキメラタンパク質（BACCS）を作製し，HEK293T 細胞に発現させたと ころ，青色光依存的な細胞外カルシウム流入が生じた。ヒトの STIM1 由来の BACCS （hBACCS）は幾つかの 哺乳類由来の Orai1 を活性化できたが，ショウジョウバエの Orai は活性化できなかった。一方ショウジ ョウバエ由来の BACCS （dBACCS）はショウジョウバエの Orai を活性化できたが，HEK293T 細胞で発現させ てもカルシウム流入は起こさなかった。しかしショウジョウバエの Orai を共発現させることで，カルシウ ム流入を引き起すことができた。これらの光による細胞内カルシウム濃度上昇により，NFAT 転写因子を介 した遺伝子発現を制御することが可能であった。哺乳類由来培養細胞では dBACCS は hBACCS よりも，光に 対して高効率なカルシウム流入が生じていた。そこで LOV2 に変異アミノ酸を導入した dBACCS を作製し， 光に対する応答性の改善を試みたところ，光照射後，速やかに反応が収束する変異体と，ほとんど不活性化 が起こらない２つのタイプの変異体を得ることができた。また BACCS システムは遺伝子改変マウスでも利 用できることがわかった。以上のことから，カルシウムを介した細胞機能の研究に BACCS が有用であるこ とが示された。また哺乳類と昆虫で，Orai のカルシウム透過性に関する機能が異なることが示唆された。 ｂ） 近年，生物学における Bottom-up 研究手法として，微小加工技術を利用して生体外に細胞環境を再現 し，通常の in… vitro 実験技術では実現できない生体機能を発現させる Organ-on-chip 技術が注目を集 めている。当研究室ではイオンチャネルを発現する細胞の微小環境を制御し，新たな実験プラットフォーム の開発やセンサーとしての応用展開を試みている。 細胞表面の流体移動は化学物質の検知だけでなく，細胞に負荷する剪断応力として様々な影響を及ぼし， 特に血管上皮細胞の分化と恒常性に大きく関わる。したがって，通常の平面培養では生体内の上皮細胞機能 を発現させることはできない。微小流路を利用した疑似血管環境下で胎盤由来上皮細胞を培養し，剪断応力 を加えたところ，通常の培養では見られない微絨毛形成が誘導された。剪断応力は TRPV6 イオンチャネル を介した細胞外カルシウム流入を活性化し，細胞内カルシウム濃度上昇を引き起した。このカルシウム濃度 上昇は，微絨毛形成に関わる Ezrin のリン酸化に必要であった。リン酸化された Ezrin は速やかに微絨毛 へ移行し，その結果，剪断応力負荷後，一時間以内で微絨毛形成が起こっていた。以上のことから TRPV6 イオンチャネルは血流を介した剪断応力を感知する分子であり，カルシウム流入を制御することで上皮細胞 の微絨毛形成に関わることが明らかになった。また Organ-on-chip 技術による新たな実験手法は，既存の 技術で実現できない生体環境の再現に有効であり，脱・動物実験を加速できる技術であることが示唆された。 ４）学術論文