试验三大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.pptVIP

大肠杆菌感受态细胞制备及转化 实验目的 掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法 掌握转化的方法技术 了解转化过程中各因素对转化率的影响 感受态及转化实验原理 定义 感受态（Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA 的状态 转化（transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g. 枯草杆菌） 在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g .大肠杆菌） 受体菌与质粒的选择 受体菌： E.Coli DH5α：无Ap抗性 外源质粒 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 选择: 如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α 、JM109 、 TG1 ； 用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)； 制备感受态细胞方法 原生质体法 电击法 特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法 转化率定义及计算 公式： 转化子数/ug DNA = 单菌落数 质粒浓度(ng/ul) X 1uL 2.5ng/uL 影响转化效率的因素 细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态 OD值：0.3－0.5 (5X107个/ml) 试剂的质量： 化合物及无机离子：Rb+、Mn+、二甲亚砜等 质粒：大小、构型 外源DNA（质粒）与细胞的比例： 器皿的洁净度 污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行 感受态细胞的保存 实验器材 摇床 分光光度计 冷冻离心机 超净工作台 恒温水浴 涂布棒 恒温培养箱 实验试剂 LB液体培养基 LB固体培养基 氨苄青霉素 0.1 M CaCl2 30% 甘油 实验流程 6. 用冰预冷的1mL0.1M的CaCl2 处理、悬浮细 胞， 7 . 冰上20min 8. (取1.5mL)5000rpm离心5min，倾去上清 9. 100uL CaCl2轻轻悬浮，冰浴 实验流程 实验流程 1.实验样品: 吸取50uL 感受态细胞到另一个1.5 ml EP管中，加入1uL 质粒（枪头轻轻混匀，勿吹 打） 2.阴性对照： DH5 α感受态细胞50uL 冰浴20mins 42℃ 90秒（静置，勿摇动） 迅速放到冰上,冰浴2mins 加入950uL LB培养基，标明组号，37 ℃ 200rpm 摇床培养 45 mins 制备LB琼脂平板(已完成) 含Ap的LB固体培养基倒平板, 每组5个. （编号1,2,3,4,5） 不含Ap的LB固体培养基平板。（编号6） 涂布 样品(转化培养后的菌液),涂布于1,2,3,4,5号平板，各100uL。 阴性对照(转化培养后的菌液) 100uL ：涂布于6号平板。 静置15mins, 倒置平板37 ℃ 培养过夜 涂布棒的使用 酒精灯的使用 使用前，浸入75%酒精中； 在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）； 等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却； 涂布均匀； 将涂布棒重新除菌以备下一次使用。 观察结果（明天上午） 预期实验结果： 1-4号平板上出若干单菌落，说明？ 5号平板上没有可见菌落，说明？ 6号平板上出现大量菌落，说明？ 计数单菌落,计算转化率. * * 细菌产生感受态的类型 + 质粒DNA 420C热击 复苏 Amp+ 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形, 外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面, 经短时间420C热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间，使抗氨苄青霉素的表型表达后 再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上，长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。 X10x1000 制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管 轻轻混匀----可以用tip头轻轻搅匀. 4℃保存（不加甘油），可保存一周； 加30%甘油，-20 ℃保存，可保存一月； 加30%甘油， 80 ℃保存，可保存六月； 1、接单菌落到5ml LB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜 2、5%（250 ul) 菌液接种到含5 ml LB的试管中， 370C振荡培养1-2小