氨基酸发酵生产的研究进展.docxVIP

氨基酸的研究进展 摘要　由于氨基酸在食品、饲料、医药、农业和日用化工等方面有极其广泛的用途,尤其随着抗癌药物制剂、氨基酸输液制剂及甜味二肽生产的飞速发展,对原料氨基酸的需求量日益增长。传统的发酵工业越来越不能满足需求,势必被以基因工程为基础的新兴发酵工业所代替。通过对发酵法生产氨基酸的历史进行回顾,及对未来前景作出展望,指出了运用DNA重组、定向突变等手段,对代谢途径及关键酶进行了深入系统的研究的必要性。 关键词　发酵法　氨基酸生产　基因工程 3. 1　载体-受体系统及克隆表达的研究 3. 1. 1　受体的获得 目前使用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族,通常是通过诱变选育出的基础产率较高的菌株。大肠杆菌遗传背景研究得清楚,载体系统完善,利于工程菌的构建,但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外,为应用带来困难。棒状杆菌能克服这两个缺点,但载体受体系统研究较晚且有限制修饰系统的障碍,所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待解决的问题。有报道表明,可通过给目的基因加上前导肽,使蛋白产物分泌至胞外;可对受体菌加热处理,暂时抑制其限制修饰系统[1]。 3. 1. 2　载体的构建 有效的载体需要有在受体菌中可启动的复制起始位点,这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得[2];载体所需的筛选标记及外源基因插入的多克隆位点,可从常用的克隆载体中获得。在此基础上,引入tacP /lacIQ系统,得到能靠IPTG浓度来调节基因表达的载体;为了利于寻找有启动子活性的序列,引入lacZ基因,构建了启动子探测载体[3];通过引入mob基因,得到了可移动载体,可将携带的外源基因以同 源重组的方式与染色体整合[4]。 3. 1. 3　基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌,CaCl2转化法对它不适用,通常采用的方法有:原生质体转化、转导,电转化,接合转移。原生质体转化的方法是较早采用的方法,由于受到原生质体再生条件的局限,效率不高;电转化方法由于高效,快速被广泛使用,目前它的转化效率可达到原生质体转化法的100～1000倍[5]。接合转移这种传统的重组方法近年来由于可移动载体的应用而发展,可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移,并且可将外源基因整合于染色体上,易于稳定遗传[6]。 3. 2　氨基酸生物合成途径的研究 想要培育出某种氨基酸的产生菌,首先要了解这种氨基酸的生物合成途径、关键酶的反馈调控机制,考虑解除的方法,从而设计正确的育种方案。 3. 2. 1　共同途径 代谢途径可分为共同途径和分支途径。共同途径为分支途径提供前体物质。对共同途径的研究的焦点在于代谢过程的关键分支点。根据现有的研究资料,EP是各个酶系统竞争的对象[7]。丙酮酸激酶将PEP转化为丙酮酸, PEP羧化酶、PEP羧激酶将PEP和CO2转化为草酰乙酸;DAHP合成酶将PEP与4-磷酸赤藓糖合成DAHP。目前对代谢途径的研究,主要是通过插入法取代某些基因,或使酶基因失活,从而 研究基因产物的功能。Gulber等在研究PYK的功能时,根据其N端序列合成PCR引物,扩增得到PYK基因内部片段,用可移动质粒PSU301导入棒杆菌中同源重组,得到PYK突变体,来研究PYK基因的功能。 3. 2. 2　分支途径 分支途径通过若干个酶系,将共同的前体物质转化为不同的氨基酸。途径的研究热点在于关键酶的克隆与调控。参与氨基酸发酵的关键酶主要有12个,每个分支途径都有一到数个关键酶,生物合成的途径越长,关键酶的数目越多。关键酶中有的是变构酶,有的是同功酶,也有的多功能酶,它们在于由同一前体出发去合成多种氨基酸的关键点上。目前,许多关键酶的基因已被克隆:Ozaki等克隆了谷氨酸棒杆菌的分支酸变位酶和预苯酸脱水酶基因,通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌,产量提高了50%[8]。Katsumata克隆了谷氨酸棒杆菌的阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因,使色氨酸的产量提高了54%[9]。 3. 3　酶调控方面进展 3. 3. 1　酶量的调控 酶量的调控也可视为酶基因转录的调控,在产氨基酸途径上的关键酶的表达,受到调节基因产物与代谢终产物的共同影响。诱导物利于酶在浓度高时的合成,而阻遏物抑制酶的合成。Yang等对TyrR基因的研究表明,它是一个调节基因,调控着大肠杆菌中8个转录单位的·21·氨基酸和生物资源阐明氨基酸生物合成系统调节机制的基础上发展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。这样,几乎所有的氨基酸都能生产出来。随着重组DNA技术的发展,接合、转导、转染、细胞融合等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建生产菌株的尝试。70年代末至80年代初期,随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的发展。苏氨酸等的生产菌株被成功地构建并应用于工业