甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的cDNA-SRAP差异显示.pdfVIP

甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的cDNA-SRAP 差异显示1 马爱芬，李加纳，谌利，钱伟，付福友，刘列钊 西南大学农学与生物科技学院，农业部生物技术与作物品质改良重点实验室，重庆市油菜工 程技术研究中心，重庆 (400716) E-mail: liezhao2003@126.com 摘 要：为探寻甘蓝型油菜黄黑籽之间的种皮色泽表达差异的分子基础，探索cDNA-SRAP 差异显示的可行性，选用培育7 年的重组自交系群体（RILs ），根据群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA ）构建了种子的RNA 混合池，利用cDNA-SRAP 法进行了差异显 示研究。996 对SRAP 引物组合扩增出2100 条带，2 次扩增重复率为65.2% ，其中在黄黑籽 材料之间重复稳定出现的差异片段有 12 条，长度在 100~300bp 之间。选择其中7 条差异片 段，进行回收、克隆和测序，发现 2 个片段分别与拟南芥的NAD+ADP 核糖转移酶及小肽 转移蛋白3 具有很高的同源性。结果表明，利用 SRAP 方法可以对甘蓝型油菜cDNA 混合 池进行差异显示研究，2 条差异片段可能与甘蓝型油菜的种皮色泽基因表达相关。 关键词：甘蓝型油菜；cDNA–SRAP；群体分离分析法；差异显示 中图分类号：Q343.1+5 1. 引 言 [1] 从1992 年梁鹏等建立mRNA 差异显示技术 （mRNA differential display,DD ）以来，该 技术得到日益广泛的应用，特别是在筛选某些表型相关的新基因方面更是取得了重大进展 [2] 。Kaoru [3 ]等人1994 年提出用RAPD 引物筛选随机扩增的cDNA 差异显示方法。随着差 异显示技术的发展，出现了cDNA-AFLP 差异显示技术[4] 。 Li 和Quiros[5] 建立了相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)标记技术。 SRAP标记所用的模板可以是DNA ，也可以是cDNA 。Li等[6]利用SRAP技 术对花椰菜与花茎甘蓝的杂交双二倍体的mRNA进行反转录得到的cDNA进行扩增，用48对 引物组合标记88个cDNA样品，得到281个多态性条带。卢泳全等[7]应用SRAP技术对大米草 的耐盐性状进行差异显示研究，鉴定出一个与水稻的β-1,3-葡聚糖酶有30%相似性的差异片 段。 自Michelmore[8]等1991 年提出群体分离分析法（Bulked Segregant Analysis, BSA ）以来， BSA 法已经广泛运用于植物抗、耐等性状的基因分离及鉴定。在油菜遗传育种中，目前大 家关注的热点之一是选育甘蓝型黄籽油菜，不仅因为黄籽较相同遗传背景的黑籽的含油量及 蛋白质含量高，而且黄籽油菜的粗纤维含量低[9] 。本研究根据BSA 原理构建甘蓝型油菜黄、 黑籽RNA 混合池，进而反转录形成cDNA 混合池。以cDNA 混合池做SRAP 差异显示研究， 期望获得与甘蓝型油菜种皮色泽表达相关的基因信息。对了解甘蓝型油菜种皮色泽表达差异 的遗传分子机理有重要意义，对甘蓝型油菜黄籽育种工作有很好的辅助作用。 2. 材料与方法 2.1 材料 选自重庆市油菜工程研究中心的重组自交系群体（RILs ）。由GH06 ×中油821 选系杂交 1本课题得到国家自然科学基金重点项目）、高等学校博士学科点专项科研基金(20040625007)的 资助。 - 1 - 经一粒传法连续自交7 代，父本中油821 选系是性状稳定的黑籽材料，母本GH06 为具有一 个显性黄籽主效基因的黄籽材料，该亲本黄籽度达到90%，黄籽率100%，黄籽性状表现稳 定[10] 。根据BSA 法选取连续7 代黄籽度为90%，黄籽率100