温和噬菌体.ppt

四类病毒及其繁殖方式 原核生物病毒 植物病毒 人类和脊椎病毒 昆虫病毒 噬菌体 噬菌体（phage,bacteriophage）即原核生物的病毒，包括噬细菌体（bacteriophage）,噬放线菌体（actinophage)噬蓝细菌体(cyanophage)等。在自然界中分布广泛，有原核有原核生物的地方就有相应的噬菌体。 噬菌体 噬菌体种类 主要为六种主要形态①A型，dsDNA，蝌蚪状，收缩性尾②B型，dsDNA，蝌蚪状，非收缩性尾③C型，dsDNA，非收缩性尾④D型，ssDNA，球状，无尾，大顶衣壳粒⑤E型，ssRNA，球状，无尾，小顶衣壳粒⑥F型，ssDNA，丝状，五头尾 噬菌体构造 1.噬菌体的繁殖 　一个典型的噬菌体的侵染细菌的过程，可以分为三个阶段：感染阶段、增殖阶段和成熟阶段。 感染阶段 噬菌体侵染寄主细胞的第一步是“吸附”，即噬菌体的尾部附着在细菌的细胞壁上，然后进行“侵入”。噬菌体先通过溶菌酶的作用在细菌的细胞壁上打开一个缺口，尾鞘像肌动球蛋白的作用一样收缩，露出尾轴，伸入细胞壁内，如同注射器的注射动作，噬菌体只把头部的DNA注入细菌的细胞内，其蛋白质外壳留在壁外，不参与增殖过程。 吸附 吸附于大肠杆菌上的噬菌体 吸附于大肠杆菌性毛上的噬菌体 (2)侵入（penetration） 侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量。?不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同。 ????T4通过尾丝吸附于宿主E.coli 表面。吸附后，由于基板受到构象上的刺激，中央孔开口，释放溶菌酶并水解部分细胞壁，接着尾鞘蛋白收缩，把尾管插入宿主细胞中。 侵入 通过尾部刺突固着于细胞；?尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，是细胞壁产生小孔；?尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外； 增殖阶段： 噬菌体DNA进入细菌细胞后，会引起一系列的变化：细菌的DNA合成停止，酶的合成也受到阻抑，噬菌体逐渐控制了细胞的代谢。噬菌体巧妙地利用寄主(细菌)细胞的“机器”，大量地复制子代噬菌体的DNA和蛋白质，并形成完整的噬菌体颗粒。噬菌体的形成是借助于细菌细胞的代谢机构，由本身的核酸物质操纵的。 据观察，当噬菌体侵入细菌细胞后，细菌的细胞质里很快便充满了DNA细丝，十分左右开始出现完整的多角形头部结构。噬菌体成熟时，这些DNA高分子聚缩成多角体，头部蛋白质通过排列和结晶过程，把多角形DNA聚缩体包围，然后头部和尾部相互吻合，组装成一个完整的子代噬菌体。 成熟阶段 噬菌体成熟后，在潜伏后期，溶解寄主细胞壁的溶菌酶逐渐增加，促使细胞裂解，从而释放出子代噬菌体。在光学显微镜下观察培养的感染细胞，可以直接看到细胞的裂解现象。T2噬菌体在37 ℃下大约只需四十分就可以产生100～300个子代噬菌体。子代噬菌体释放出来后，又去侵染邻近的细菌细胞，产生子二代噬菌体。 释放 众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞破裂的现象称之为自外裂解（Lysis from without）。 自外裂解是不能产生子代噬菌体的裂解方式。?平均每一个宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体数称作裂解量（burst size）。 ?????丝状噬菌体（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒粒的组装 噬菌体效价的测定 ??? 在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的负菌落称噬菌斑。可用作噬菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。 效价(滴度Title)-------是微生物或其产物、抗原与抗体等活性 高低的标志。 噬菌体效价--------指噬菌体的浓度，即每毫升样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数，以每毫升中含有的噬菌斑形成单位（plaque forming unit/ml或pfu/ml)表示其效价。 噬菌体效价测定法 一. 点滴法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24小时。 2. 取300 μl 寄主细菌悬浮液加入5 ml 冷却至45℃的0.7﹪琼脂培养基中，均匀混合后立即平铺于已凝固的1.8﹪琼脂培养基上，并静置30分钟以上使其凝固。 3. 以1% peptone为稀释液，将噬菌体原液做10倍序列稀释，一般稀释至107倍即可。 4. 将平板划分为八个区域，以pipetman取不同稀释倍数之噬菌体稀释液各 1 μl，分别接种于不同的区域上。 5. 将平板置于适合的温度下，一般培养8~24小时，待溶菌斑产生后观察并计算其数目。一般噬菌体浓度太高的区域会融合成一个大的溶菌斑，而浓度适中的区域会形成肉眼可观察的溶菌斑。 6. 噬菌体效价 (pfu/ml)＝溶菌斑数×稀释倍数×取样量折算