如何选择无细胞蛋白表达系统 - 生物在线.DOC

如何选择无细胞蛋白表达系统 【字体：大 中 小】　　　　时间：2009年2月11日0　　 　　来源：Promega  与基于细胞的蛋白表达系统相比较，无细胞蛋白表达系统具有独特的优势，包括节约时间、提高具有功能的、可溶的、全长蛋白的总体产量。至于如何选择无细胞蛋白表达系统，让Promega的专家一一道来。  GARY KOBS, PROMEGA 公司 在此，我们介绍了根据模板类型、期望产率以及下游实验等因素来选择无细胞蛋白表达系统的标准。 介绍 与基于细胞的蛋白表达系统相比较，无细胞蛋白表达系统具有独特的优势，包括节约时间(图1)、提高具有功能的、可溶的、全长蛋白的总体产量。此外，无细胞蛋白表达系统更适用于激酶等毒性蛋白的表达、也可使用经过修饰的tRNA来进行标记，在某特定位点掺入非天然的氨基酸。同时，这些系统还可以用于高通量实验(1)。我们提供完备的无细胞蛋白表达系统，为研究者提供了多种选择，可用于进行蛋白的特征描述，包括免疫沉淀、Pull-down实验和酶学检测。 图1. 与细胞内蛋白表达相比，无细胞蛋白表达系统能够显著地节约时间。 选择一个无细胞蛋白表达系统，最主要的几点考虑因素包括细胞提取物或裂解物的来源、模板以及期望的蛋白产量。本文介绍的信息可帮助研究者选择适合其实验体系和下游应用的无细胞蛋白表达系统。 考虑因素 — 模板 在使用插入片断或载体进行真核细胞系统蛋白表达时，有以下几个因素需要考虑：(i)ATG起始密码子应该是位于转录起始位点下游的第一个ATG密码子；(ii)理想化而言，在启动子之后，ATG应该包含在Kozak共有序列之内；(iii)在模板序列的3端应包含终止密码子；(iv)终止密码子之后应带有合成的多聚A尾(2)。此外，使用TNT? T7麦胚偶联系统(TNT? T7 Coupled Wheat Germ System)时，载体还应包含一个T7终止子序列或该载体呈线性化。 在原核系统中，起始密码子的选择几乎无一例外地依赖于核糖体结合位点(ribosomal binding site, RBS)的存在，这个位点包含了阅读框架的起始信号(2)。经过优化的核糖体结合位点能够大大提高原核细胞内蛋白的表达。原核系统不识别位于ATG起始密码子上游的任何ATG，除非这些ATG含有一个处于合适位置的核糖体结合位点。 使用兔网织红细胞裂解物(Rabbit Reticulocyte Lysate, RRL)时，DNA介导的蛋白合成与mRNA为起始的蛋白合成相比较，具有以下优点：当进行高水平的蛋白合成时，不需要处理mRNA的繁杂操作过程。 基于真核细胞RNA的翻译 在1950至1960年间，研究人员证实了兔网织红细胞裂解物可以经过人为操作，用于外源mRNA介导的蛋白合成，这样可以只把感兴趣的蛋白合成出来(1)。经过核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物和Flexi?兔网织红细胞裂解物均增加了一些添加剂，为mRNA的翻译过程进行了优化。这些添加剂包括氯高铁血红素—用于防止亚铁血红素调节的elF-2α激酶(HRI)的激活作用；能量生成系统，含有经过测试的磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸；以及小牛肝脏tRNA—用于平衡消耗的tRNA种类，这样可以优化密码子的使用，并扩大可被高效率翻译的mRNA的范围。与经过核酸酶处理的兔网织红细胞裂解物相比较，Flexi?兔网织红细胞裂解物系统可提供更强的灵活性，能够将翻译反应的很多参数进行优化，这些参数包括Mg2+浓度、K+浓度，以及DTT的存在与否。 麦胚提取物(Wheat Germ Extract, WGE)含有合成蛋白所需要的细胞组分(tRNA、核糖体、起始因子、延长因子以及终止因子)。该提取物系统做了进一步优化：添加了由磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶组成的能量生成系统；添加了亚精胺，用于加强蛋白链延长的效率，以防止蛋白链的终止过早地发生；添加了醋酸镁，并使其浓度适合大多数种系mRNA的翻译。最后，还单独提供了醋酸钾，以用于优化更多种类的mRNA。 麦胚提取物适用于表达小分子的蛋白，或用于表达富含于兔网织红细胞裂解物中的蛋白。当RNA制备物中含有少量的dsRNA或硫醇时，该系统也很适用，上述这些物质具有抑制翻译的作用。在表达植物蛋白、酵母蛋白或其它真菌蛋白时，研究人员也会发现麦胚提取物比兔网织红细胞裂解物更合适。 基于真核细胞DNA的转录和翻译 二十世纪九十年代，偶联的转录/翻译(即TNT?)系统被开发出来，该系统包含兔网织红细胞裂解物或麦胚提取物，并带有T7、T3或SP6 RNA聚合酶，这些系统使基于DNA的蛋白合成成为现实。 TNT?兔网织红细胞裂解物转录/翻译偶联系统(TNT? Coupled Reticulocyte Lysate Transcription/Translation System