体外组装含有组蛋白变体h2az 及h33的核小体.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（３）：５３６０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 体外组装含有组蛋白变体 Ｈ２Ａ．Ｚ 及Ｈ３．３的核小体 １，２ ２ ２ ２ ２ 赵宏宇 　刘　媛 　张凤慧 　邢永强 　蔡　禄 （１内蒙古大学物理科学与技术学院　呼和浩特　０１００２１　２内蒙古科技大学数理与生物工程学院　包头　０１４０１０） 摘要　核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位，组蛋白变体Ｈ２Ａ．Ｚ及 Ｈ３．３对染色质结 构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制， 体外重构含有Ｈ２Ａ．Ｚ及Ｈ３．３的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法 之一。实验表达纯化了６种组蛋白，在复性的过程中装配了含有Ｈ２Ａ．Ｚ和 Ｈ３．３的组蛋白八聚 体。基于ＤＮＡ序列１０ｂｐ周期性及序列模体设计了３条易于形成核小体的ＤＮＡ序列，通过ＰＣＲ 大量扩增的方法，回收了标记 Ｃｙ３荧光分子的目的ＤＮＡ序列。采用盐透析法体外组装了含有 Ｈ２Ａ．Ｚ和Ｈ３．３的核小体结构，利用荧光标记、ＥＢ染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体 的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现，设计的３条ＤＮＡ序列可以有效 地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构，而且随着组蛋白八聚体与ＤＮＡ比例的增加，核小体的 形成效率显著提高；采用Ｃｙ３荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方 法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。 关键词　组蛋白变体　核小体定位　染色质结构　荧光标记 中图分类号　Ｑ８１６ 　　核小体是构成真核生物染色质的基本结构。Ｈ２Ａ、 　　组蛋白变体Ｈ２Ａ．Ｚ与常规组蛋白Ｈ２Ａ序列相似 Ｈ２Ｂ、Ｈ３和Ｈ４四种组蛋白各２个拷贝组成八聚体核 度仅为６０％，研究认为，Ｈ２Ａ．Ｚ在基因快速启动转录过 心颗粒，约１４７ｂｐＤＮＡ序列以左手螺旋的方式在其上 程中发挥作用，也有少量报道发现，在基因转录过程中 缠绕约１．７５圈，在组蛋白Ｈ１的协助下形成稳定的染 ［３４］ Ｈ２Ａ．Ｚ起抑制作用 。组蛋白变体Ｈ３．３与常规组蛋 色质高级结构。在真核生物 ＤＮＡ复制和基因转录过 白Ｈ３仅有４个氨基酸不同，大量的研究发现，Ｈ３．３在 程中，染色质结构及其动态变化过程会影响反式调控 转录活性较高的基因、启动子及转录调控元件区域的 ［１］ ［５６］ 因子与 ＤＮＡ序列的结合及相关蛋白质的招募 。 染色质上占据水平较高 。在体内，组蛋白变体 Ｈ２Ａ．Ｚ和Ｈ３．３是两类染色质结构上较为常见的组蛋 Ｈ２Ａ．Ｚ和Ｈ３．３可以协同构建特定的染色质构象调控 白变体，进化上序列高度保守，对染色质结构动态变化 ［１，５］ 基因的转录 。 ［２］ 和基因转录起着非常重要的调控作用 。 　　在染色质层次上研究这些变体对基因表达调控的 影响时，体内实验易受到较多因素的影响。在体外重 构含有Ｈ