实验八蛋白质的变性与沉淀 - 欢迎进入兰州大学数字化学习中心.doc

医学生物化学实验指导 （供临床、预防、口腔、药学、影像、检验、麻醉专业本科使用） 医学生物化学与分子生物学研究所 兰州大学基础医学院 2006年6月  目 录 第一章 普通实验 1 实验一 肌糖原的酵解作用 1 实验二 影响酶活性的因素 4 实验三 碱性磷酸酶Km值测定 7 实验四 乳酸脱氢酶及辅酶Ⅰ、琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 9 实验五 酮体的生成与利用 12 实验六 血清丙氨酸氨基转移酶测定 14 实验七 分光光度法测定血红蛋白含量及血糖 16 实验八 蛋白质的变性与沉淀 23 实验九 血清蛋白质的醋酸纤维薄膜电泳 25 第二章 综合实验 27 实验一 质粒DNA的提取及电泳鉴定 27 实验二 鸡卵类黏蛋白的制备及活力的测定 29 实验三 动物肝脏DNA的提取与二苯胺测定 36 实验四 酵母RNA的提取及醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸 39 第三章 选择实验 43 实验一 蛋白质的两性性质及等电点的测定 43 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白印迹 45  前 言 生命科学在20世纪有了惊人的发展，生物化学是其中最活跃的分支学科之一。人类基因组计划的启动和进展，更显示出生物化学实验技术是生命科学研究领域和临床诊疗应用领域中一项非常重要的基本技术。近几年来，我国高等教育的步伐也在不断的加快，不少院校组建了生命科学学院或生物学院，相继建立了生物技术，生物工程、生物科学等新专业。因此，作为医药院校的学生必须掌握基本的生物化学实验技能，了解生物体内基本物质成分的分离、分析和鉴定常用方法以及物质代谢的研究方法，并通过实验技术加深对理论知识的理解，增强分析问题和解决问题的能力。 本书的实验方法严谨可靠，可操作性强，实用性强，具有部分工具书的属性。适用于高等医药院校基础生物化学实验教学，可供临床医学、药学、医学检验、口腔、预防、护理等专业根据各专业特点选择使用。 尽管我们用最大努力来编写本教材，由于能力有限总不免有许多不足与疏漏之处，谨望广大师生在使用当中多提宝贵中肯的意见，以便更好地完善教材。 编者 2006年6月 第一章 普通实验 实验一 肌糖原的酵解作用 [目的] 1、学习检定糖酵解作用的原理和方法。 2、了解酵解作用在糖代谢过程中的地位及生理意义。 3、了解有关组织代谢实验应注意的一些问题。 [原理] 在动物、植物、微生物等许多生物机体内，糖的无氧分解几乎都按完全相同的过程进行。1/n （C6H10O5）n + H2O 2CH3CHOHCOOH [实验器材] ⑴ ⑵移液管：5ml2ml、1ml、0.5ml。 ⑶滴管。 ⑷量筒。 ⑸恒温水浴。 ⑹沸水浴。 ⑺小台秤。 ⑻剪刀及镊子。 ⑼漏斗。 ⑽冰浴。 [材料与试剂] ⑴ ⑵0.5%糖原溶液（0.5%淀粉溶液） ⑶液体石蜡。 ⑷15%偏磷酸溶液。 ⑸氢氧化钙（粉末）。 ⑹浓硫酸。 ⑺饱和硫酸铜溶液。 ⑻0.067mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）。 ⑼1.5%对羟基联苯试剂：对羟基联苯1.5g，溶于100ml0.5%氢氧化钠溶液中配成1.5%的溶液。若对羟基联苯颜色较深，应用丙酮或无水乙醇重结晶。此试剂放置时间长久后会出现针状结晶，应摇匀后使用。 [操作方法] 管号 试验管 对照管 1 2 3 4 新鲜肌肉糜（g） pH 7.4磷酸缓冲液（ml） 0.5 3 0.5 3 0.5 3 0.5 3 0.5%淀粉溶液（ml） 1 1 1 1 15%三氯醋酸（ml） ― ― 2 2 用玻璃棒将肌肉碎块打散、搅匀 液体石蜡（ml） 1 1 1 1 37℃水浴保温1h 15%三氯醋酸（ml） 2 2 ― ― 混匀、过滤 滤液（ml） 4 4 4 4 饱和CuSO4溶液（ml） 1 1 1 1 混匀 Ca (OH)2粉末（g） 0.4 0.4 0.4 0.4 间断震荡30min，过滤 滤液（ml） 0.25 0.25 0.25 0.25 冰浴冷却 预冷浓硫酸（ml）（逐滴加入，边加边摇） 1.5 1.5 1.5 1.5 沸水浴5min，冷却 对羟基联苯试剂（滴）（滴到液面上） 2 2 2 2 充分摇匀，室温放置20min，其间不断混摇数次。 如显色慢，沸水浴90sec，比较颜色。 注：用CuSO4与Ca (OH)2作用生成的CaSO4和Cu (OH)2胶状沉淀可吸附糖类而去掉样本中糖的干扰。 [注意事项] ①对羟基联苯试剂一定要经过纯化，使其呈白色。 ②在乳酸测定时，试管必须洁净、干燥，防治污染而影响结果。所用滴管大小尽可能一致，减少误差。如显色较慢，可将试管放入37℃恒温水浴中保温10min，再比较各管颜色。 [思考题] 本实验在保温前不加液体石蜡是否可以？为什么？ 本实验如何检验