利用类弹性蛋白可逆相变和内含肽自切割功能高效制备tmsm - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１０）：８９９５ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 利用类弹性蛋白可逆相变和内含肽自切割功能 高效制备ＴｍＳｍ抗肿瘤蛋白  石　磊　唐莉莉　马兴元 　王天文　马　飞　王　平 （华东理工大学 生物工程学院生物反应器工程国家重点实验室　上海　２００２３７） 摘要　目标蛋白ＴｍＳｍ是研发出的一种能够较强抑制肿瘤细胞生长和促进其凋亡的基因工程抗 肿瘤蛋白，其由介导目的蛋白进入细胞的转导肽ＨＩＶＴＡＴ突变体（Ｔｍ）和Ｓｕｒｖｉｖｉｎ突变体（Ｓｍ）融 合而成。原先的ＴｍＳｍ制备工艺以包涵体表达、变性和复性为主，其过程不仅复杂、收率低成本 高，而且所得蛋白活性较低。通过将 ＴｍＳｍ基因与编码类弹性蛋白（ｅｌａｓｔｉｎｌｉｋｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ， ＥＬＰｓ）和内含肽（ｉｎｔｅｉｎ）的标签序列（ＥＩ）进行融合，利用ＥＬＰｓ的可逆相变特性和ｉｎｔｅｉｎ的自切割 功能，经简单的温度及ｐＨ调控，获得了纯度为９９．００％的ＴｍＳｍ蛋白。将纯化后的蛋白作用于肺 癌细胞Ａ５４９，２４ｈ后ＭＴＴ结果显示，６３．２１ ｇ／ｍｌ的目的蛋白对Ａ５４９的抑制率为５７．８３％；流式 μ 细胞仪检测结果表明，当ＴｍＳｍ浓度为４０ ｇ／ｍｌ时，２４ｈ后细胞凋亡率为４１．７２％。因此，这种新 μ 型的以类弹性蛋白和内含肽介导的表达纯化技术不仅成本低廉，而且对抗肿瘤蛋白药物的质量 提高具有重要应用价值。 关键词　类弹性蛋白　内含肽　重组蛋白ＴｍＳｍ　高效制备　肺癌细胞Ａ５４９ 中图分类号　Ｑ８１９ 　　Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是 １９９７年发现的凋亡抑制蛋白家族 　　类弹性蛋白（Ｅｌａｓｔｉｎｌｉｋｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＥＬＰｓ）是一 （ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＩＡＰｓ）的一个新成员，其 ［５］ 类哺乳动物弹性蛋白的衍生物 。它由五肽重复序列 主要功能是抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的增殖， 单元 ＶＰＧＸＧ（ＶａｌＰｒｏＧｌｙＸａａＧｌｙ）构成，其中Ｘａａ为 并参与细胞有丝分裂的调控［１２］。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白第３４号 ［６］ 除了Ｐｒｏ以外的任意一种氨基酸 。ＥＬＰｓ具有可热诱 密码子的突变（Ｔ３４Ａ）能导致其功能逆转，具有抑制肿 导的相变特性，即其存在一个相变温度，称之为反转相 ［３］ 瘤细胞增殖和促进凋亡的作用 。本实验室将具有跨 变温度（ｉｎｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，Ｔｔ）。当温度低于 膜转导作用的ＨＩＶＴＡＴ突变体与 Ｓｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔ３４Ａ）融 Ｔｔ时，ＥＬＰｓ以单体形式存在，高度可溶；当温度高于Ｔｔ 合，首次制备出ＨＩＶＴＡＴＳｕｒｖｉｖｉｎ（Ｔ３４Ａ）融合蛋白，简 ［７８］ 时，ＥＬＰｓ相互聚集形成多聚体，高度不可溶 。此相 ［４］ 写为ＴｍＳｍ 。目前ＴｍＳｍ的制备工艺较为成熟，主要 变过程完全可逆，称之为可逆相变循环 （ｉｎｖｅｒｓｅ 依赖于原核表达包涵体的变复性和层析技术，然而如 ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｃｙｃｌｉｎｇ，ＩＴＣ）。当将目的蛋白与ＥＬＰｓ融合表 何显著提高ＴｍＳｍ的纯度与活