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学校代码：1 0 0 6 2 学 号：2006062116 本科毕业论文（设计） UNDERGRADUATE DISSERTATION 论文题目: 游离脂肪酸对肝细胞NADPH氧化酶 TITLE Role of Free Fatty Acid on NADPH Oxidase Expression and Reactive Oxygen Species Production in Hepatocytes 院 系 生物医学工程学院 专 业 生物医学工程 年 级 2006级 学生姓名 李萌 指导教师 黎健 教授 毕平 副教授 2010年6月 目 录 中文摘要 2 英文摘要 3 1．前言 5 2．研究对象和方法 7 2.1 主要材料、试剂与仪器设备 7 2.2 试剂配制 9 2.3 HepG2细胞培养 10 2.4 Palmitate(棕榈酸)及其它试剂处理HepG2细胞 10 2.4.1 Palmitate处理时间和浓度确定 10 2.4.2确定Palmitate处理HepG2时ROS的主要来源 11 2.4.3 Palmitate处理HepG2时NOX亚单位的变化 11 2.5 免疫荧光法检测亚细胞定位 11 2.6 Western blot检测蛋白表达及磷酸化水平 11 2.6.1细胞蛋白的提取 11 2.6.2蛋白含量的测定 11 2.6.3 SDS凝胶电泳 12 2.6.4蛋白质的电转移 12 2.6.5蛋白质杂交 12 2.7 流式细胞术检测ROS 13 2.8 HepG2细胞糖原含量检测 13 3．结果 14 3.1 FFA对HepG2细胞内ROS产生的影响 14 3.1.1 Palmitate升高HepG2细胞内ROS水平的作用呈浓度依赖性 14 3.1.2 Palmitate作用不同时间对HepG2细胞内ROS水平的影响 14 3.2 NOX是FFA诱导HepG2 产生ROS的主要来源 15 3.3 FFA对HepG2细胞NOX3及其亚单位表达的影响 16 3.4 FFA对NOX3激活的调节机制 17 3.5 高FFA诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗 18 4．讨论 19 5．结论 22 致谢 22 参考文献 23 缩略词表 英文缩写 英文全称 中文名称 ROS Reactive oxygen species 活性氧RNS Reactive nitrogen species 活性氮自由基FFA Free fatty acids 游离脂肪酸TNF-α Tumor necrosis factor-α 肿瘤坏死因子-α本研究旨在探讨NOX3源性ROS在FFA诱导的肝脏胰岛素抵抗发生中的作用机理。首先我们用不同浓度（0.15-0.35mmol/L）Palmitate (棕榈酸)处理人肝脏细胞HepG2，通过DCFH－DA荧光染色结合流式细胞术检测ROS水平的改变。分别用产生ROS途径的抑制剂如NOX抑制剂DPI（iphenyleneiodoniumcloride）、线粒体呼吸链酶复合体抑制剂Rotenone、环氧合酶抑制剂L-NAME和黄嘌呤氧化酶抑制剂Oxypurinol处理进一步应用Western blot分析NOX亚组分的表达变化。检测细胞内糖原合成来观察细胞的胰岛素抵抗。与正常培养条件相比，Palmitate导致HepG2细胞中ROS水平的显著升高，其作用具有浓度和时间依赖性。DPI和Rotenone处理组的ROS水平显著降低，其中DPI降低ROS水平的作用最为显著，而其他抑制剂处理组的ROS水平无明显变化。提示NOX是高FFA诱导HepG2细胞产生ROS的主要来源。Western blot结果表明，HepG2表达NOX3、p22PHOX、p47PHOX和Rac-1。NOX3和p47 PHOX的表达在0.25mmol/L Palmitate处理后显著升高，p22PHOX Rac-1则无显著性改变。观察Palmitate对NOX3活性的调节机理的结果表明，在0.25mmol/L Palmitate作用下，HepG2细胞的NOX3活性主要是通过p47PHOX的膜移位来调节。用检测细胞内糖原合成来观察细胞的胰