重组酿酒酵母催化二氢大豆苷元生产雌马酚.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（４）：４１４５ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 重组酿酒酵母催化二氢大豆苷元生产雌马酚 １，２ １ １ １ １ １ 刘玉雪 　张昕 　王　磊 　林心萍 　朱志伟 　赵宗保 （１中国科学院大连化学物理研究所生物技术部　大连　１１６０２３　２中国科学院大学　北京　１０００４９） 摘要　雌马酚是大豆异黄酮的代谢产物，是一种天然的选择性雌激素受体调节剂，稳定性和生物 学活性高。为实现雌马酚的微生物合成，采用模块途径工程策略，构建编码雌马酚合成关键酶基 因ｏｒｆ１、ｏｒｆ２和ｏｒｆ３的表达载体，成功用于转化酿酒酵母ＢＹ４７４１，得到工程菌株。结果表明，工 程菌株有效表达了外源基因，并可将大豆异黄酮代谢中间体二氢大豆苷元转化为雌马酚。为构 建从头合成雌马酚的微生物细胞工厂提供了重要科学参考。 关键词　雌马酚　二氢大豆苷元　酿酒酵母　生物催化 中图分类号　Ｑ８１２ 　　大豆异黄酮与雌激素结构相似，能与 、 两种雌 前，人们已成功构建了合成大豆苷元、葛根素等异黄酮 αβ 激素受体（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲ）结合，是一类天然的选 类化合物的酵母工程菌株［１２］。最近，从成人粪便中分 ［１］ 离得到可转化大豆苷元至雌马酚的细菌 Ｓｌａｃｋｉａｓｐ． 择性雌激素受体调节剂。据报道 ，大豆异黄酮可以 用来预防一些与雌激素水平下降相关的疾病如妇女更 ｓｔｒａｉｎＮＡＴＴＳ，分离鉴定出３个关键酶ＯＲＦ３（ＩＤＮｏ．： 年期综合症、乳腺癌症等，还具有降低胆固醇、调节血 ＢＡＬ４６９３０）、ＯＲＦ２（ＩＤＮｏ．：ＢＡＬ４６９２９）和ＯＲＦ１（ＩＤ 脂和延缓衰老等功效，且无明显毒副作用。 Ｎｏ．：ＢＡＬ４６９２８），完成了功能验证，即它们分别催化转 　　雌马酚（ｅｑｕｏｌ，ＥＱＬ）是大豆异黄酮的一种代谢产 化大豆苷元到二氢大豆苷元（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ，ＤＨＤ）、 物。研究表明大豆异黄酮的生物学功效在一定程度上 ＤＨＤ到四氢大豆苷元 （ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ，ＴＨＤ）和 ［２］ ［１３］ 可能归因于雌马酚 。雌马酚具有一对对映异构体的 ＴＨＤ到雌马酚（图１） 。这些关键元件使构建微生物 外消旋体化合物（Ｓ型和Ｒ型），研究表明Ｓ雌马酚对 细胞工厂，生产雌马酚成为可能。 ［３］ 　　本文旨在构建酿酒酵母工程菌，使其携带 Ｓ雌马 βＥＲ的亲和力要比Ｒ型高１３倍、比消旋体高２倍 ； 因此，Ｓ雌马酚的合成及其药理活性成为研究热点。Ｓ 酚合成途径中３个关键酶的基因ｏｒｆ１、ｏｒｆ２和ｏｒｆ３，研 雌马酚可通过化学合成或微生物转化的方法获得。以 究工程菌株的催化性能，为微生物转化大豆苷元到雌 大豆苷元、对羟基苯乙酸、间苯二酚等为原料，经过４ 马酚提供科学参考，为实现雌马酚的微生物从头合成 ［４７］ 奠定基础。 步或更多步反应得到雌马酚 ，虽然产量较高，但副 产物多，立体选择性低，分离纯化较困难。微生物转化 １　材料与方法 ［８］ 可得到构型单一的产物Ｓ雌马酚 。已发现少数肠道 ［９］ １．１　材　料 菌株可转化大豆苷或大豆苷元为Ｓ雌马酚 ，但这些 １．１．１　试剂　ＤＮＡ